哈维氏弧菌核酸检测试剂盒（一管式恒温荧光法）

◆ 产品说明

动物疫病检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于哈维氏弧菌的检测，检出限为10³copies/μl基因组DNA。

◆ 产品组成（48测试）

◆ 适用仪器

Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒温荧光检测仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光PCR仪。

◆自备耗材和仪器

①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；④离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴

◆注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

1）第一区：样本制备区。

2）第二区：模板添加区。

3）第三区：扩增及产物分析区。

★分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

参照下述方法处理样品。

一. 直接检测

1. 病灶组织

(1)若对样本不增菌直接进行检测，则取患病动物的病灶组织做匀浆备用。

2. 水体

1）取10～100mL养殖水，用筛网过滤，取滤液通过0.22um的硝酸纤维膜过滤；

2）将滤膜剪碎振荡重悬于500 μL 0.9% NaCl水溶液或无菌生理盐水，12000 rpm 离心5 min，尽量弃净上清液。

二. 增菌检测

取待检样品25g（mL），加入225mL的 TYE液体培养基，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1 min，或者拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵或均质袋中磨碎，再加入10mL TYE液体培养基，于摇床培养24h。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

1. 模板制备（样本制备区）

1.1不增菌直接检测

请参照水生动物病害基因组DNA快速提取试剂盒说明书的提取步骤。

1.2 增菌后检测

1）取增菌液1~2 mL，10000 rpm 离心5 min，弃上清液；

2）加入500 μL 无菌0.9% NaCl水溶液或医用生理盐水，10000 rpm 离心5 min，尽量弃净上清液，保留管底沉淀；

3）混匀提取液后，向管底沉淀中加入100 μLDNA提取液，剧烈涡旋混匀，100℃加热10 min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10 min；

4）10000 rpm离心2 min，将上清转移至新的离心管中低温保存备用或现场完成检测。

2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

取出所需测试数的已含有反应液的PCR管，将试剂完全解冻，解冻后打开管盖向各管管底分别加入1μL B-I，盖上管盖离心1 min。打开管盖分别沿各管管壁上加入2μL模板，顺序为NG-I、待测样品模板、PG-VH-I。盖好PCR管盖后，离心3 min，立即进行PCR扩增反应。

3. 扩增反应（扩增及产物分析区）

①恒温仪器63℃条件下反应30 min。

②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，30个循环。

若使用其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

◆ 结果判定

①恒温仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有哈维氏弧菌；若显示“阴性”，则样品中不含有哈维氏弧菌或含量低于检测限。如在20min~30min间出现曲线上扬而自动判读结果为阴性，可能由于样品含量较低导致，建议对样品进行富集或延长反应时间至45min进行复核。

②在荧光定量PCR仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有哈维氏弧菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有哈维氏弧菌或含量低于检测限。                         

• NG反应管结果显示“阴性”，PG反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。