野菊花超临界二氧化碳萃取物的抗炎活性及其机理研究
野菊花是传统的清热解毒药,具有清热解毒,疏风解热的功效,临床上常用于治疗上呼吸道感染、急性扁桃体炎及流感、腮腺炎等等,而这些功效在现代医学上均属于炎症反应范畴。现代药理学研究也表明,野菊花具有显著的抗炎作用。应用超临界二氧化碳萃取技术提取野菊花中的有效成分,保留了野菊花中的挥发油、萜类、酚酸及黄酮类等热不稳定性成分,且提取效率高,工艺稳定、环保。目前,野菊花超临界二氧化碳萃取物已成功运用到药物、功能食品、化妆品、日化产品上,但尚未有文献报道相关的药理活性。传统的临床应用,均是基于野菊花的抗炎活性。并且已在复方野菊花抗感软胶囊应用,证实了具有较强的的抗炎活性。因此,本文拟对野菊花超临界二氧化碳萃取工艺进行考察,联合GC-MS和HPLC对其化学成分进行分析；并对其抗炎作用及机理进行研究。研究结果,有助于阐明野菊花超临界二氧化碳萃取物的化学成分及其药理活性,为其合理应提供科学依据。 方法： 1、野菊花超临界二氧化碳萃取工艺考察与化学成分分析通过采取正交设计方法优化野菊花的超临界二氧化碳萃取工艺。选取萃取压力,萃取温度,萃取时间作为考察因素,设计3个水平,以萃取率为指标,选用L9(34)正交表进行试验。 分别用正己烷及70%甲醇对野菊花超临界二氧化碳萃取物进行萃取,正己烷提取物用GC-MS进行分析,70%甲醇提取物用HPLC进行分析。 2、野菊花超临界二氧化碳萃取物的抗炎活性研究 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型,测定左右耳重量差异,耳廓肿胀度和耳廓肿胀抑制率,比较组间差异。 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制醋酸致小鼠毛细血管通透性模型,测定腹腔灌洗液的OD值差异,计算通透性增强度及通透增强抑制率,比较组间差异。 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制角叉菜胶致小鼠足肿胀模型,分别测定0,1,2,3,4,5,6h时肿胀足跖的体积,计算足跖肿胀度和肿胀抑制率,比较组间差异。 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制角叉菜胶致小鼠足肿胀模型,在造模后4h时,处死小鼠,取各组小鼠的足跖和肝脏。观察足跖病理切片的差异；测定足跖组织中MPO, iNOS和COX-2的活性；测定足跖组织中MDA, TNF-a, IL-1β, IL-6, NO, PGE2和NF-κB的含量；测定肝脏组织中SOD, GPx和GRd的活性。 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制棉球致小鼠肉芽肿模型,称量肉芽肿的重量,比较组间差异。3、野菊花超临界二氧化碳萃取物对LPS诱导的急性肺损伤的影响 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制气管滴注LPS复制小鼠急性肺损伤模型,观察各组小鼠的生存情况,每6时观察一次,并记录死亡时间,考察120小时。 KM小鼠口服给予野菊花超临界二氧化碳萃取物(40,80and120mg/kg),连续7天,每天1次,末次给药1小时后,复制气管滴注LPS复制小鼠急性肺损伤模型,观察肺部组织病理切片的差异；测定肺湿/干重；测定肺泡灌洗液中蛋白的含量；计算肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞总数及巨噬细胞总数；测定肺组织中MPO, SOD, GPx及CAT的活性；测定肺组织中MDA, TNF-α, IL-1β及IL-6的含量；Western-blot法测定肺组织中TLR4/MyD88/NF-κB通路相关指标的蛋白表达水平。 4.野菊花超临界二氧化碳萃取物的急性毒性的初步研究 采用半数致死量实验和最大耐受量试验相结合的方法,评价KM小鼠急性毒性实验中提取物的最大给药剂量和急性毒性反应 结果： 1、野菊花超临界二氧化碳萃取工艺考察与化学成分分析 影响萃取率因素的主次关系是萃取压力萃取温度萃取时间。野菊花超临界二氧化碳萃取的最佳工艺为萃取压力25MPa,萃取温度45℃,萃取时间3h,萃取物得率为5.12%。 GC-MS共鉴定了野菊花超临界二氧化碳萃取物中的35种成分,主要成分有eucalyptol (3.091%), a-thujone (2.186%), β-thujone (2.169%), d-camphor (8.582%), cis-verbenol (4.720%), endo-borneol (7.845%), bornyl acetate (2.948%), thymol(3.071%), β-caryophyllen(3.336%), cis-β-farnesene(2.270%), α-curcumene (5.932%), caryophyllene oxide (8.460%), α-gurjunene (2.161%), aromandendrene (2.280%), α-bisabolol (2.289%), longifolenaldehyde (2.572%),a-bisabolol oxide (2.600%), a-linolenic acid (2.130%), ethyl octadec-9,12-dienoate (2.470%)。 HPLC共鉴定了野菊花超临界二氧化碳萃取物中的五种成分,分别是：蒙花苷、绿原酸、金合欢素、木犀草素及木犀草苷。 2、野菊花超临界二氧化碳萃取物的抗炎活性研究 在二甲苯致耳廓肿胀模型中,野菊花超临界二氧化碳萃取物可以显著减少造模小鼠左右耳重量的差值,从而减轻肿胀度。说明其对二甲苯所致的耳廓肿胀有抑制作用。 在醋酸致毛细血管通透性模型中,野菊花超临界二氧化碳萃取物可以显著减少造模小鼠腹腔灌洗液的OD值。说明其对醋酸所致的毛细血管通透性有抑制作用。 在角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型中,野菊花超临界二氧化碳萃取物可以明显减少造模小鼠足跖肿胀体积,从而减轻肿胀度；可以减少足跖组织病理形态的改变；可以抑制足跖组织中MPO, iNOS和COX-2的活性；可以降低足跖组织中MDA, TNF-α, IL-1β, IL-6, NO, PGE2和NF-κB的含量；可以抑制肝脏组织中SOD, GPx和GRd的活性。上述结果说明野菊花超临界二氧化碳萃取物对角叉菜胶所致的足跖肿胀有抑制作用。 在棉球致小鼠肉芽肿模型中,野菊花超临界二氧化碳萃取物可以明显造模小鼠肉芽肿的重量,说明其对棉球所致的肉芽肿有抑制作用。 3、野菊花超临界二氧化碳萃取物对LPS诱导的急性肺损伤的影响 在LPS诱导的急性肺损伤模型中,野菊花超临界二氧化碳萃取物可以提高急性肺损伤小鼠的生存率；可以减轻肺组织病理切片的改变；可以减轻肺湿／干重；可以降低肺泡灌洗液中蛋白的含量：可以减少肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞总数及巨噬细胞总数；可以抑制肺组织中MPO, SOD, GPx及CAT的活性；可以降低肺组织中MDA, TNF-α, IL-1β及IL-6的含量；可以抑制肺组织中IκBα的磷酸化水平,上调细胞浆内p65的蛋白表达水平,下调细胞核内p65的蛋白表达水平,降低TLR4和MyD88的蛋白表达水平。 4.野菊花超临界二氧化碳萃取物的急性毒性结果 无法进行半数致死量的研究,口服给予提取物的单次最大耐受量大于4g/kg。 结论： 考察了野菊花超临界二氧化碳萃取的工艺,发现最佳工艺为萃取压力25MPa,萃取温度45℃,萃取时间3h,萃取物得率为5.12%。采用GC-MS和HPLC对野菊花超临界二氧化碳萃取物的化学成分进行分析,鉴定了40个成分,主要为烯类、萜类、酚酸类及黄酮类成分；通过体内抗炎活性研究,证实了野菊花超临界二氧化碳萃取物具有较强的抗炎活性。此外,通过LPS诱导的急性肺损伤实验,证实了野菊花超临界二氧化碳萃取物可提高急性肺损伤小鼠的生存率,对急性肺损伤小鼠具有良好的保护作用,其潜在机理可能是下调TLR4/MyD88/NF-κB通路的蛋白表达,抑制炎症介质的释放和提高抗氧化酶的活性。急性毒性研究也表明,野菊花超临界二氧化碳萃取物的单次最大耐受量大于4g/kg,服用安全无毒。
