DC(树突状细胞)的制备方法（三）
3. DC 细胞的培养及鉴定
3.1 步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x 106/ml，置于培养瓶内；
3.2 37℃，5% CO2 培养箱中孵育 2h，以使单核细胞贴壁；
3.3 洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人 GM-CSF(500-1,000U/ml)和重组人 IL-4 (500U/ml)的无血清培养液，37℃，5% CO2 培养箱中培养，诱导单核细胞向 DC 细 胞分化；
3.4 每 2-3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
3.5 (可选步骤) 在培养的第 5d， 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 μg/ml，对 DC 进行 抗原负载；
注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。
3.6 在培养的第 6d，加入重组人 TNF-α(10ng/ml)，IL-1β(10ng/ml)，IL-6(1000U/ml)和 PGE2(1μg/ml)，诱导 DC 细胞成熟；
3.7 在培养的第 7d 或第 8d，收获 DC 细胞，其数量应达到 1×106 个以上；
3.8 DC 的质检：
3.8.1 活细胞比例：台盼蓝染色验证活细胞应在 90%以上；
3.8.2 形态学观察：>90%细胞半悬浮，细胞有多个树突样突起；
3.8.3 细胞表型分析(见下图)：流式细胞术检测 DC 细胞表面 CD14、HLA-DR、 CD40、CD80、CD83 和 CD86 等分子的表达，成熟的 DC 不表达 CD14， 而高表达其他分子。CD83 是成熟 DC 的特异性标志，在单核细胞和不成熟 DC 表面不表达或低表达。
3.8.4 无菌检测：收获细胞前取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、 衣原体，均应为阴性；
3.8.5 内毒素检测：收获细胞前取少量培养物，回输前，用鲎试剂检测内毒素含量， 标准：内毒素<0.5 EU/ml。
【DC 培养试剂推荐】
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 | 使用浓度 |
| PeproTech | 重组人 GM-CSF (Animal Free) | AF-300-03 | 5mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg | 50-100ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IL-4 (Animal Free) | AF-200-04 | 5mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg | 100ng/ml |
| PeproTech | 重组人 TNF-a (Animal Free) | AF-300-01A | 10mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg | 10ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IL1-b (Animal Free) | AF-200-01B | 2mg/10mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg | 10ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IL-6 (Animal Free) | AF-200-06 | 5mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg | 100ng/ml |
| PeproTech (BioGems) | PGE2 (前列腺素 E2) | 3632464 | 10mg/50mg | 1mg/ml |
注：Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛的病原体和蛋白的混 入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体（如疯牛病，克雅氏病等）的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。
【DC 鉴定试剂推荐】
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 克隆号 | 荧光标记 | 产品规格 |
| PeproTech (BioGems) | 抗人 CD14 荧光标记抗体 | 6211 | 61D3 | FITC/PE/APC/PerCP-Cy5.5 | 25tests/100test |
| 抗人 CD40 荧光标记抗体 | 2511 | 5C3 | FITC/APC | 25tests/100test | |
| 抗人 CD80 荧光标记抗体 | 2911 | 2D10.4 | FITC/PE | 25tests/100test | |
| 抗人 CD83 荧光标记抗体 | 5911 | HB15e | FITC/PE | 25tests/100test | |
| 抗人 CD86 荧光标记抗体 | 8911 | IT2.2 | PE | 25tests/100test | |
| 抗人 HLA-DR 荧光标记抗体 | 74111 | LN3 | FITC/PE/APC/PerCP-Cy5.5 | 25tests/100test |
注：用于 DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。为避免多色分析时补偿调 节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做 DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来 排除背景染色。
【参考文献】
[1] Steinman RM, Cohn ZA.
Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of
mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med.
1973; 137 (5): 1142–62.
[2] Bender A, Sapp M, et. al. Improved
methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating
progenitors in human blood. J Immunol Methods. 1996; 196(2):121-35.
[3]
Romani N, Reider D, et. al. Generation of mature dendritic cells from
human blood. An improved method with special regard to clinical
applicability. J Immunol Methods. 1996; 196(2):137-51.
[4] Jonuleit
H, Kühn U, et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce
maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf
serum-free conditions. Eur J Immunol. 1997; 27(12):3135-42.
[5]
Datta J, Terhune JH, et al. Optimizing dendritic cell-based
approaches for cancer immunotherapy. Yale J Biol Med. 2014;
87(4):491-518.
[6] de Jong EC, Vieira PL, et al. Microbial compounds
selectively induce Th1 cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic
cells in vitro with diverse th cell-polarizing signals. J Immunol. 2002
Feb 15;168(4):1704-9.
[7] 张志伟，宋鑫。DC-CIK 细胞临床制备规范化研究。中国肿瘤，2011；20(2)：85-88。
