LaVision双光子显微镜-亚细胞水平的深层组织成像（五）
结论
这些结果表明红外双光子和二次谐波产生显微成像对于无毒害的时间分辨的细胞行为调查的深层组织成像尤其有利。作为与其它脉冲飞秒激光系统相比的优势，如Ch:forsterite (1230 nm) 和 Fianium fiber (1064 nm) 激光器，OPO产生的波长是可调谐的，适用于以一种弹性方式在它们的激发峰段对红色和近红外荧光团进行激发。由于没有分辨率方面的主要损失，1100nm到1300nm波长范围非常适用于红色和近红外荧光团，以及遗传编码的红移荧光蛋白(DsRed2, mCherry, TurboFP) 的双光子激发和宽带SHG，然而与NIR激发相比，它的限制性水分吸收倍增了间质组织和细胞丰富组织的穿透深度。
强化IR-MPM的深入发展包括进一步的红移遗传编码荧光蛋白的构造；用于识别具有类似发射光谱的多光子荧光IR激发的荧光寿命成像研究；与光学相干层析的结合，用于预选感兴趣的研究区域；合适的光学器件的补偿。对于组织中的深层成像后者尤其重要，因为细胞膜，脂肪沉着体，及类似物造成的折射率局部改变削弱了激发波前，并因此显著地削弱PSF。在这个双光子显微镜中，不只是导致了图像质量的下降，而且导致了荧光的重大损伤，因为信号依赖于激光能量的平方。使用合适的光学器件和对给定深度进行一个单独的形状校正将会补偿样品产生的80%的畸变。
Figure 6 一个固定的淋巴结内树突细胞（DC）的3D重构。在腘窝淋巴结抑制前24小时，将同源未成熟的CMTR阳性DC注入Balb/C小鼠的脚掌中。 (a) 一个880nm激发波长的重构和(b)作为穿透深度功能的归一化的红色荧光(虚线区域的Z面测得). (c) 1100nm激发波长的重构(d)400–700 µm深的深层T细胞区域处的XY切片。激发能为 110 mW (1100 nm) 和 180 mW (880 nm). 标尺，100 µm.
利用三次谐波产生THG和OPO激发CARS（相干反斯托克斯现象）的IR多光子显微成像对于原生状态的细胞和组织结构成像非常有用。三次谐波产生THG是一种由三阶非线性过程产生的类似SHG的非线性光学显微技术。因为非线性地依赖于激发能，THG具有内在光学切片的特点。它与近红外波长（1-2um）混合时非谐振的特性使得这种技术对于生物和非生物样品成像非常有趣。
Nd:vanadate或者Ti：Sa激光器与泵浦OPO共同使用将充分使得CARS成为一个原生状态细胞和组织成像的有力工具。因此，Ti：Sa激光作为泵浦光束，而OPO激光作为CARS非线性过程的Stoks光束，适用于活细胞的脂类代谢和细胞器运输方面的研究。
同时使用绿色和红色荧光团将会从当前的Ti：Sa和OPO系统发展中得到很多益处。最新的Ti：Sa激光器超过4W的一般特征性能量输出可以提供给两个激发光束几个100mw的能量。最后，一个新的OPO晶体的产生将会在一个宽范围调谐泵浦光束带宽因此支持绿色和红色荧光团的在各自激发峰同时激发。总之，越红越好的普遍观点对于深层组织双光子显微镜在生物医药研究的宽的应用范围内是正确的。
Addresses
1 University of Wu¨ rzburg, Rudolf-Virchow Center for Experimental Biomedicine and Department of Dermatology, Venerology, and Allergology, Josef-Schneider-Strasse 2, 97080 Wu¨ rzburg, Germany
2 LaVision BioTec GmbH, Meisenstrasse 65, 33607 Bielefeld, Germany
3 AntiCancer, Inc., 7917 Ostrow Street, San Diego, CA 92111 and Department of Surgery, University of California, San Diego, 200 West Arbor Drive, San Diego, CA 92103-8220, USA
4 Microscopical Imaging Centre, Department of Cell Biology, Nijmegen Center for Molecular Life Science, Radboud University Nijmegen Medical Centre, P.O. 9101, 6500 HB, Nijmegen, The Netherlands
Corresponding author: Friedl, Peter (P.Friedl@ncmls.ru.nl)
