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UPLC SYNAPT 二级质谱方法用于 siRNA 寡核苷酸结构确证

2020.7.13

简介

RNA 干涉( RNAi )机制在转录后基因沉默中有根本性的作用,在已知序列的情况下,基因沉默常规实验可通过使用 ~21 个核苷酸( nt )长度的合成 RNAi 探针进行,此法也用于研发药物。

合成 RNAi 寡核苷酸须纯化以防靶点外的基因沉默。 RNAi 药物需要良好的实验描述,以达到法规要求,将可能的安全有效性的不良作用降低到最小。

沃特世超高效液相色谱( UPLC ® )技术的高分离度色谱能力与质谱联用分析是分析 siRNA 寡核苷酸等生物药物的有力手段。作为寡核苷酸确证的一部分,可通过选择性酶或化学物进行测序。二级质谱碎片分析方法为快速通用方法,可用于修饰后的寡核苷酸(通常对酶切有抵抗力)。为获得完整的 21 核苷酸 RNAi 的结构信息,二级质谱分析中其分子须有效离子化并产生与序列相关的离子,质量精确性与分离度也需适当。

本应用手册提供了精确 UPLC/MS/MS 分析方法用于 21 核苷酸 RNA 结构确证的流程。该法对确认 siRNA 碱基药物的序列是非常有用的。

实验条件

样品制备

21 核苷酸长度的互补 RNA 链(上游序列 5’ -UCG UCA AGC GAU UAC AAG GTT -3’ ,下游序列 5’ -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3’ )在 0.1 M 乙酸三乙胺( TEAA )中分别重组。

合成副产物的分布与上下游序列一并通过 UPLC/MS 检测。用于 UPLC/MS 分析的样品浓度为 30 pmol/μL 。

方法

UPLC/MS 分析与前述一致。 1 沃特世 ACQUITY UPLC ® 系统适配了 ACQUITY UPLC 寡核苷酸分离技术( OST ) C 18 柱( 1.7 μm , 2.1 x 50 mm ; PN 186003949 ),质谱参数的选择旨在达到最佳 TEA 加合物的去聚集效果,而不影响先导离子强度。沃特世 SYNAPT™ HDMS™ 质谱在飞行时间 TOF )模式下操作。

选择离子的诱导解离碰撞能量梯度为 25 -55 V 。 MS/MS 碎片程度通过选择合适的电荷状态( -3 到 -6 )与不同的碰撞能梯度进行调整。产物离子谱在 500 -7000 m /z 范围内进行采集,采集率为 1 次扫描 / 秒。负离子模式的外部校正使用了碘化铯。使用了 MaxEnt™3 软件进行了数据分析前的图谱去卷积。

LC 条件

LC 体系: 沃特世 ACQUITY UPLC 系统
色谱柱: ACQUITY UPLC OST C 18 1.7 μm , 2.1 x 50 mm
柱温: 60 °C
进样量: 5 μL
流速: 0.2 mL/min
流动相 A : 15 mM TEA , 400 mM HFIP
流动相 B : 50% A , 50% 甲醇
梯度: 10 分钟内 B 液含量从 20-40%

MS 条件

MS 系统: 沃特世 SYNAPT HDMS 系统
毛细管电压: 2.7 V
样品锥孔电压: 31 V
提取锥孔电压: 3 V
源温度: 120 °C
脱溶剂气温度: 300 °C
脱溶剂气流流速: 500 L /h
碰撞阱能量: 6 V
传输碰撞能量: 4 V
质量分辨率: V 模式下 ~ 9000 ( FWHH )
LockMass : CsI 10 mg/mL (水 - 异丙醇, 1 : 1 ),流速为 5 μL/ 分钟,扫描时间 1 秒,频率 30 秒,设定质量 1685.765 m /z ( Cs 6 I 7 - )

结果与讨论

碰撞能量模式影响了 MS/MS 碎片产生的程度,能量值须根据对应分析物进行调整。一般来说,用于 21 核苷酸长度分析物 MS/MS 碎片化最广的带电状态是 -5 与 -3 ( 1500 -2000 m /z 范围内)。 25-45 V 的碰撞能梯度对 21 核苷酸 RNA 产生结构可用的碎片是合适的。

总体上,为获得 MS/MS 碎片的合理的信噪比( S/N ),总离子色谱图( TIC )中主成分或污染物须具有最低 500 离子数的信号。

互补 RNA21 核苷酸链分别进样至 UPLC/MS/MS 系统,色谱显示了较短的寡核苷酸峰( 5’ 水解产物),它们可以根据原目标 21 核苷酸得到很好的解析(图 1 )。成分峰的归属是根据其精确质量测量进行的,可确证部分序列。 1

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为鉴定全核苷酸结构, 21 核苷酸下游链的先导离子 [M-4H] 4- 进行了分离与碎裂(图 2 )。主要的特征碎片是互补的 c y 离子和 低强度 [a-B] 以及 w 离子(命名见图 3 )。上述 5’-P-O 断裂 序列的离子是 RNA 寡核苷酸 MS/MS 分析的主要碎片,与 DNA 产生的产物(主要是 3’-C-O 断裂的 [a-B] 与 w 离子) 不同。这是因为 DNA 分子缺乏 2’- 羟基。 2

双链骨架断裂产生的内部碎片与 c 离子的 胞嘧啶中性缺失(表 1 )显著较少,且对结构鉴定有意义的峰归属没有贡献。上游 21 核苷酸 RNA 的 MS/MS 分析,碰撞能梯度( 30-50 V )产生的结果近似(图 2 )。

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图 2 21 核苷酸 RNA 寡核苷酸的 MaxEnt3 去卷积 MS/MS 图谱。星号为谐波峰(去卷积的结果)

MS/MS 的 [M-4H] 4- 图谱中所有的碎片离子中, 21 个核苷酸的 RNA 通过几种电荷状态表示(表 1 )。 MS/MS 图谱的多电荷离子去卷积通过 MaxEnt 3 软件进行,显著降低了图谱复杂性,简化了 MS/MS 数据解读。

去卷积图谱已足够用于解读整个 siRNA 序列(图 2 ),还检测到了几个代表了 21 核苷酸分子离子的 A , G 与 C 气相核碱基损失的峰。 LockMass 校正后质量精确度达到了 10 ppm 以下,对手工数据解析是很有用的(表 1 )。三重四级杆质谱的质量分辨率与离子阱仪器可能不能足以进行特征碎片归属以区别多电荷峰与其他寡核苷酸复杂碎片产物。

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结论

开发了通过精确质量 UPLC/MS/MS 进行可靠的测序,以用于 siRNA 寡核苷酸结构确证的方法。

•  SYNAPT HDMS 系统的高质量精确性与分辨率可达到清晰碎片离子归属要求。
•  可靠的 MS/MS 方法可产生特征离子碎片,覆盖了较广的质量范围,足以用于 21 个核苷酸的 siRNA 序列的解析。
•  MaxEnt 3 去卷积软件极大地降低了 MS/MS 图谱的复杂性,简化了序列解析过程。

本高效确证性测序法对依照美国 FDA 生物药物化合物规定测定药用寡核苷酸序列十分有用。本法还可能用于计算机测定未知杂质序列。可预计,本 MS/MS 方法可用于外切酶难以切断的化学修饰寡核苷酸(阶梯测序)。

自动化的 MS/MS 可减少数小时乃至几天的分析时间,降低样品分析成本。另外, UPLC 还可快速分离目标 RNA 类群,多种寡核苷酸链可同时进行 MS 与 MS/MS 分析。 UPLC 分离目标寡核苷酸与其被剪切产物的能力对于 siRNA 代谢研究是十分有利的。

参考文献

1. UPLC/MS Analysts of Interfering RNA Oligonucleotides. Waterrs Application Note.2008 : 720002412en.
2. Kirperkar F , Krogh TN. Rapid Commun 。 Mass Spectrom 。 2001 ; 15 ( 1 ): 8-14.
3. Adopted from McLuckey SA, et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom 。 1992 ; 3 ( 1 ) 60-70.


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