实时荧光定量PCR的研究进展及其应用（一）

 (张蓓，沈立松  上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心实验诊断中心)

摘要:多聚酶链反应飞速的发展使其成为了分子生物学实验室重要的工具，实时荧光定量PCR(real-timequantitative PCR)技术以其敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一步。本文对real-timeQ-PCR技术的原理、五种主要的荧光化学及定量方法作一介绍，同时也讨论了此技术存在的不足，并对其目前在研究领城中主要的应用进行了概述。

多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术发明至今已近20年了，在这期间其技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。

1实时荧光定量PCR技术的方法学

1.1原理

所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进

程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time令PCR方法在研究工作中的运用。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-timeQ-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-timeQ-PCR反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的域值，一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline),荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到的荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(CO.Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1.2荧光化学

目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是:DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。

扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBRgreen1[33等荧光染料。Real-timeQ-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR反应体系中，加入过量SYBRgreen1荧光染料，SYBRgreen1荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线(meltingcurve)分析的软件加以解决。

扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的墓因特异寡核普酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略川。目前在real-timeQ-PCR中最广泛使用的TagMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核普酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5，端荧光墓团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭墓团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5'端荧光墓团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿摸板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5'-3'外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5'端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3，端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光。分子信标(molecularbeacon)['〕就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光墓团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭墓团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种:日出引物(sunriseprimes)和蝎子引物(scorpionprimes)。杂交探针(hybridizationprobe)使用两个特异的探针，其中上游的探针的3'端标记有供体荧光素(donor)，而下游的探针的5‘端标记有受体荧光素(acceptor)。在PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能f转移(FRET，此作用与上述水解探针的方式相反)，使得受体荧光墓团发出荧光;当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核普酸熔解曲线(meltingcurve)对与寡核普酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。