肿瘤异质性作为癌症生物学最主要的特征之一，是癌症研究者必须考虑的问题。对处于正常组织背景下的肿瘤而言，可能包含多种不同亚型，这些亚型可能含有各自独特的突变信息，这种异质性对癌细胞的耐药性及肿瘤的复发起着关键性的作用。

　　论文第一作者Alexis Guernet突破性地将CRISPR/Cas9技术与生态学中常用的DNA条形码技术联用（即CRISPR-条形码技术），通过在基因组特殊位置插入一系列点突变来标记和追踪含有特定突变的肿瘤细胞亚型，建立了肿瘤细胞异质性背景下的耐药模型。研究人员进一步证明发现，CRISPR-条形码技术不仅能够实现对多种基因突变的研究，也能实现对致癌驱动突变修复的研究。

　　研究背景

　　尽管肿瘤细胞的基因异质性早在数十年前就已被认识[1]，但肿瘤往往被当作一个基因均一的实体来治疗[2]。即使基于深度测序为鉴定肿瘤细胞的不同亚群提供了方法，但不能从实验上重现基因突变所赋予肿瘤细胞亚群的进化过程。

　　CRISPR作为一项基因编辑新技术，已在生物学中得到了广泛应用。由CRISPR/Cas9引起的双链DNA切口能够触发两种截然不同的DNA修复机制：非同源末端连接途径（NHEJ）和同源重组（HDR）。尽管同源重组效率低，但其能够实现DNA的精准编辑[3]，为将HDR介导的基因编辑的低效性转变为优势，研究人员采用了沉默DNA条形码偶联特定突变的方法，而这些基因标记能够通过定量PCR所准确读取来测定基因修饰的细胞与未经基因修饰的细胞的相对含量，该项技术即为CRISPR-条形码技术。

　　非小细胞肺癌的耐药性模型

　　吉非替尼是一种ATP竞争型可逆性EGFR小分子抑制剂，用以治疗非小细胞肺癌，然而易引发耐药性，这其中半数病例是由EGFR中T790M二级突变引发的[4]。研究人员在PC9细胞中引入了EGFR-T790M条形码及EGFR-T790T条形码（对照）（图1 A-B）。如图1 C-D所示，吉非替尼对细胞混合群体的处理能引起EGFR-T790M对EGFR-T790T条形码比例的上升，即吉非替尼对敏感型细胞（EGFR-T790T）造成了杀伤，而未影响到EGFR-T790M细胞的存活。

　　结果显示WZ4002（第三代EGFR非可逆性抑制剂）能够完全终止吉非替尼条件下EGFR-T790M细胞的富集（图1 E）。相似地，致癌基因KRAS突变型细胞（G12D）相比于对照组（G12G）在吉非替尼和WZ4002的作用下均产生了富集（图1 F-G），这一结果显示以受体抑制为基础的治疗能够导致替代性耐药性癌细胞亚群的选择。

　　为单独研究EGFR激活对细胞入侵能力的影响，EGFR-T790M与EGFR-T790T细胞经吉非替尼处理，使用趋化小室（Boyden chamber）进行研究（图1 H-I），结果显示，EGFR-T790M细胞富集于聚碳酸酯膜外侧，因而该种突变型细胞具有较强的侵袭能力。

　　图1 CRISPR-条形码技术重现非小细胞肺癌对EGFR抑制剂的耐药性

　　A． EGFR-T790M 及 EGFR-T790T条形码的示意图；

　　B． 引物的特异性；

　　C． 吉非替尼条件下EGFR-T790M与EGFR-T790T条形码比值的平均值；

　　D． 含有条形码的PC9细胞经不同浓度的吉非替尼处理4天；

　　E． 吉非替尼和/或WZ4002对条形码比值的影响；

　　F． 吉非替尼对条形码比值的影响；

　　G． WZ4002对条形码比值的影响；

　　H． 研究PC9细胞侵袭性的示意图；

　　I． 趋化小室膜两侧条形码的定量PCR分析。

　　复杂CRISPR-条形码的体内及体外研究

　　研究人员将染色体重排后的EML4-ALK片段整合到PC9细胞特定的基因位点中，如图2 A所示，吉非替尼的处理能诱导EML4-ALK细胞的富集，因此染色体重排可能代表一种全新的EGFR抑制剂的耐药性机理。

　　研究人员将上述含有EGFR，KRAS和EML4-ALK突变的PC9细胞混合（即PC9-EKE）（图2 B）。吉非替尼处理能够提高含有条形码的细胞占比（图2 C），因此这种复杂模型适用于联合用药的评价。如图2 D所示，尽管WZ4002和ALK抑制剂TAE684能有效防止T790M突变及EML4-ALK融合所赋予细胞的对吉非替尼的耐药性，但这些药物对KRAS突变赋予细胞的耐药性均无作用。这一结果证明，长期而言针对单一耐药性机制所采取的措施是低效的。

　　研究人员检测了曲美替尼（MEK抑制剂）的治疗效果，如图2 E所示，曲美替尼联合吉非替尼能够阻断所有吉非替尼抗性亚型的生长，这一结果证明了不同机制药物的联合使用能够防止或延缓非小细胞肺癌耐药性的出现。

　　为阐明该复杂系统在体内研究的应用，将PC9-EKE细胞注射到免疫功能低下的小鼠体内，在吉非替尼的作用下，肿瘤的生长在初期受到了抑制，但在数周之后又恢复了生长（图3 A）。图3 B显示，含PC9-EKE细胞的占比均显著上升，但存在个体差异。这一结果表明，肿瘤耐药性的选择可能是由携带不同突变信息的癌细胞亚型之间的竞争所导致。

　　图2 非小细胞肺癌对EGFR抑制剂耐药性的复杂模型

　　A. 吉非替尼条件下，含有EML4-ALK条形码细胞占比；

　　B. PC9细胞中复杂CRISPR-条形码的体内及体外模型；

　　C. 吉非替尼对PC9-EKE细胞的影响；

　　D. 吉非替尼联合WZ4002及TAE684对PC9-EKE细胞的影响；

　　E. 吉非替尼联合曲美替尼对PC9-EKE细胞的影响。

　　图3 非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的体内耐药性

　　A．将PC9细胞注入SCID小鼠，用吉非替尼处理小鼠，测量肿瘤大小；

　　B．EML4-ALK，KRAS-G12D和 EGFR-T790M 条形码的含量。

　　使用高度复杂的CRISPR-条形码技术探索瘤内异质性

　　研究人员使用该技术在BT474和PC9细胞的19号染色体的腺相关病毒整合位点（AAVS1）处插入简并序列。BT474经体外培养和移植入免疫缺陷小鼠中培养，结果显示样品中条形码的分布是相似的，而且测序结果表明在吉非替尼的作用下，数百基因条形码产生了富集。PC9-EKE细胞中上调条形码的程度大于PC9细胞。以上结果证明，在治疗开始前耐药性突变亚型细胞就已经存在。

　　研究意义

　　CRISPR-条形码技术的一个重要优势在于其可以模拟具有基因异质性肿瘤亚型的复杂群体，并根据已知机理来评价复杂群体中基因突变对于耐药性的影响，因此该项技术成功地模拟了体内肿瘤的复杂环境。该技术是一种快速且高度灵活的多种基因突变检测技术，在体内外实现了其他方法无法实现的对肿瘤细胞亚型耐药性的检测。在条形码读取方面，定量PCR、深度测序、数字PCR及Taqman 探针均能用于定量分析，因此该技术使针对癌细胞亚型耐药性的化合物高通量筛选成为可能。