荧光定量PCR检查的影响

　　1．实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

　　1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

　　2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

　　2．内标对实时荧光定量PCR的影响

　　若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

　　美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。

　　AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量pcr仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。

　　综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

　　荧光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，西安天隆生产的国产实时荧光定量PCR仪为肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、同时也为沙门氏菌阪崎氏肠杆菌等食品安全检测提供了先进手段。即使在发达国家，荧光定量PCR仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其极高的灵敏度、极宽的检测范围，以及精确定量、方便快速、无窗口期等优点，美国FDA及我国国家标准已将定量PCR仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的必备仪器。

　　实时荧光定量PCR仪（real-timeQPCR）的发明实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞跃。