检测抗生素残留常用的快速检测方法介绍
抗生素残留快速检测技术
1、传统微生物抑制试验(MIT)
分析大量样品中抗生素的残留物通常采用 MIT 法。这些方法是建立在活性药物抑制微生物生长能力的基础上。通用的抑制试验是圆盘检验技术。将样品提取液点在接种有试验菌的琼脂上,培养后可测定抗菌药物形成的抑菌圈。抑菌圈表明抗生素的存在,而圈的大小则与抗生素的浓度有关。
嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法 20世纪80～90年代,国际上公认并作为法定检测食品中抗生素残留的方法首推嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法(Paper disk method using Bacillus Steraroth-mophillus)。1977年由 Kaufman 提出,利用 Difco 抗生素4号培养基接种嗜热脂肪芽孢杆菌芽胞,把接种培养基6mL 倒入各个15mm×100mm 的培养皿中(平皿需于7天内使用),纸片直径12.7mm浸渍奶样,放于琼脂上,把平皿于64℃培养2h或者55℃培养4h。培养结束,用毫米游标尺测量抑菌圈直径,阳性结果以≥16mm 为准,能检出牛奶中青霉素含量0.005U/mL,本法可进行定量测定,1981年由FDA认可,1982年1月1日起生效为法定方法。
此法优点如下:
①用嗜热脂肪芽孢杆菌芽胞悬浮物代替藤黄八迭球菌过夜肉汤培养物做试验菌,故性质更稳定,贮存时间更长可达6～8个月。
②检测敏感度高,能检出牛奶中青霉素 G 含量为0.005U/mL(即5μg/kg)。
③方法简便、快速、省钱,2～4h 即可出现抑菌圈。
④不仅能检测青霉素 G,还能检测其他多种常用抗生素如氨苄青霉素、头孢菌素、邻氯青霉素和四环素等。
⑤可作定量测定。
⑥不受消毒剂干扰。
2、氯化三苯四氮唑法(TTC)
(1)原理 细菌生物氧化有三种方式,即加氧、脱氧和脱电子,相反即还原。当乳中加嗜热链球菌后,如乳中无抗生素,嗜热链球菌就生长繁殖,在新陈代谢过程中进行生物氧化,其中脱出的氢可以和加在乳中的氧化型 TTC 结合而成为还原型 TTC,氧化型 TTC 是无色的,还原型 TTC 是红色,所以可使乳变红色。相反,如乳中存在抗生素,嗜热链球菌就不能生长繁殖,没有氢释放,TTC 也不被还原仍为无色,乳汁也无色。
(2)检测步骤检测程序见下图
①培养基和菌种
a.脱脂乳 经113℃灭菌20min。
b.TTC 试剂 采用4%的2,3,5-氯化三苯四氮唑水溶液。
先称取2,3,5-氯化三苯四氮唑1g,溶于5mL 灭菌蒸馏水内,装入褐色瓶内,置于7℃冰箱内保存。临时再用灭菌蒸馏水稀释至5倍。如遇溶液变为玉色或淡褐色,则不能再用。
c.菌种嗜热乳酸链球菌应注意传代,以保持其生长繁殖的活力。
②操作步骤
a.菌液制备将菌种移种脱脂乳,经36℃±1℃培养15h 后,以灭菌脱脂乳1:1稀释待用。
b.取检样9mL,置15mm×150mm 试管内80℃水浴加热5min 后冷却至37℃以下加菌液1mL,36C±1℃水浴培养2h,加 TTC 0.3mL,36℃±1℃水浴培养20min,观察如为阳性,再于水浴中培养30min 作第二次观察。每份检样作二份,另外再作阴性和阳性对照各一份,阳性对照管用无抗生素的乳8mL 加抗生素及菌液和 TTC,阴性对照管用无抗生素乳9mL 加菌液和 TTC。
c.判断方法 准确培养30 min 观察结果,如为阳性,再继续培养30 min 作第二次观察。观察时要迅速,避免光照过久发生干扰。乳中有抗生素存在,则检样中虽加入菌液培养物,但因细菌的繁殖受到抑制,因此指示剂 TTC 不还原,不显色。与此相反,如果没有抗生素存在,则加入菌液即行增殖,TTC 被还原而显红色。也就是检样呈乳的原色时为阳性,呈红色为阴性,见下表。
显色状态判断标准
显色状态 | 判断 | 显色状态 | 判断 |
未显色者 | 可疑 | 桃红色～红色 | 阴性 |
微红色者 | 可疑 | 桃红色～红色 | 阴性 |
检测各种抗生素的灵敏度见下表。
检测各种抗生素的灵敏度
抗生素名称 | 最低检出量 | 抗生素名称 | 最低检出量 |
青霉素 | 0.004mg/kg | 庆大霉素 | 0.4mg/kg |
链霉素 | 0.5mg/kg | 卡那霉素 | 5mg/kg |
近年来,又有数种方法问世,国外许多公司已将有关MIT试剂盒商品化。在上述所有方法中,含有颜色指示剂的琼脂的 pH 值改变是与细菌的生长的程度成正比,这使得使用者可明显而清楚地检验可能含有的抗生素残留。虽然这些试剂盒便于使用,而且这些抑制试验也是一种很好的初筛技术,但缺乏灵敏度和特异性,不过对于其他的分析方法是一种补充,需要用其他分析法进行相互印证。
