荧光原位杂交在非整倍体植入前诊断中的应用实验

显微载玻片培养瓶巴斯德吸管微量移液器架金刚石笔洗耳球解剖显微镜倒置显微镜小型喷灯毛细吸管恒温箱微型离心机漩涡振荡器离心管

一、用于 FISH 分析的 PB1、PB2 和卵裂球（从卵母细胞和胚胎分离后）的制备

PBl、PB2 标本的制备

1.在 50 mL 培养瓶准备新鲜固定液（甲醇：冰乙酸=3:1)，在冰柜中保存备用。

2.将毛细吸管在小型喷灯的火焰上拉出内径约 50pm 的尖，内径太大可能会丢失极体。

3.加几滴固定液再处理预先处理过的玻片以清除可能存在的油脂或灰尘，用无尘纸吸干。

4.用巴斯德吸管吸少许 HPLC 纯水加到可悬挂液滴的载玻片上。

5.从卵母细胞或受精卵成功取出极体后，可以用相差显微镜（10X、20X 物镜）来观察极体，极体存在于显微操作仪上的平皿里的 20uL 培养液滴里（液滴上面用矿物油覆盖)[6]。

6.极体定位好后，用拉好的毛细吸管吸取少量水，以确定液体进出吸管的通畅。

7.在吸入少量水后，将极体轻轻吸入毛细吸管移向有水的可悬挂液滴载玻片上，从毛细吸管中轻轻吹出释放极体，直到在玻片中心的圆圈中看到极体。勿让极体固定和贴到可悬挂液滴载玻片的玻璃表面。

8.在水中漂洗片刻后，用毛细吸管重新吸入极体。极体周围的油通常可以被水洗掉。将极体移向一张干净的载玻片，轻轻吹出含极体的水滴将极体释放。

9.当水分部分蒸发后，极体开始涨大，变扁平贴到玻片表面。在水分完全蒸发完之前用同一毛细吸管滴一滴固定液在极体上，使染色质分散开。

10.在固定液完全干掉前，再滴一滴固定液固定，必要时可重复几次，直到细胞质完全溶解，仔细注意观察此过程，应尽量将细胞质去除干净（见注释 1 和 5)。

11.用金刚石笔在染色质周围画圈定位，注意不能太重，以免玻璃碎屑的影响，再用力在圆圈周围的玻片背面画另一圆圈，以便轻易找到圆圈和分析时定位染色质的位置。

12.将玻片做好标记，包括患者姓名、卵母细胞编号以及合适的信息，如染色质块数目。

13.再加数滴固定液到玻片上，用洗耳球吹干。

14.玻片可在室温放置过夜后或立即进行杂交，如果立即杂交，则推荐进行预处理。可在移植胚胎比较合理的时间范围内得到很好的结果。

15.用不褪色标记笔在玻片的背面画出极体染色体质所在，以便确定加探针的位置。

卵裂球标本的准备

1.在 50 mL 培养瓶准备新鲜固定液（甲醇：冰乙酸=3:1)，在冰柜中保存备用。

2.在一 35 mmX10mm 的有盖培养皿底部刻一圆圈便于在此区域找卵裂球，在皿内加 3 mL 低渗液。

3.将 25~50uL 毛细吸管在小型喷灯的火焰上拉出内径约 70um 的尖毛细吸管。

4.在毛细吸管吸入少量的低渗液。

5.在解剖显微镜下定位在培养液微滴内的卵裂球，再次确认制成的毛细吸管的内径比卵裂球大，可以用来吸取卵裂球；然后用它轻轻地吸取卵裂球，将卵裂球移到低渗液皿内。

6.低渗 3~5 min 后，将卵裂球吸到管内移到有少许低渗液的玻片上。

7.在倒置显微镜下持续观察卵裂球直到几乎全干。在低渗液全干形成结晶之前在卵裂球上滴上一滴固定液。持续观察细胞，在全干前滴一滴新固定液。如此重复几次，直到细胞质裂解，留下细胞核。细胞质去除是否完全直接影响杂交 (见注释 1)。

8.用金刚石笔标记卵裂球的位置以便于杂交后的定位。

9.在玻片的磨砂端注明合适的信息，再滴数滴固定液，用洗耳球吹干。

10.玻片可以进行预处理。在加探针前，用不褪色标记笔在玻片的背面标记卵裂球核的确切位置，以确定加探针的区域。

二、标本预处理

1.在 37℃的 2 X SSC (pH为7.0~7.5) 中洗 10 min。

2.在 1% 甲醛中室温条件下固定 5 min。

3.室温条件下在 1xPBS(pH 为 7.0~7.5) 中洗 5 min。

4.在 37℃的溶于 0.01mol/LHCl 的胃蛋白酶溶液中处理 5 min。

5.室温条件下在 1xPBS(pH 为 7.0~7.5) 中洗 5 min。

6.取出玻片甩掉液体，将背面残留的 PBS 擦去。

7.室温条件下将玻片在系列乙醇（70%、85% 和 100%) 中进行脱水各 1min，气干以备杂交。

8.对需要重复杂交的标本，在预处理前去掉盖玻片，将玻片置于甲醇溶液中 5 min，确保染色质固定于玻片上。

三、探针制备、杂交及洗脱

探针混合物

1.三色探针混合：先将盛探针的三个离心管离心，然后用涡旋振荡器振荡理想的探针及 LSI 探针杂交缓冲液 10s。配 10juL 的探针杂交液，也就是 13、18 和 21 号染色体探针各取 lfxL，加到盛有 7；xLLSI 探针杂交缓冲液的微量离心管中，振荡混勾、离心。

2.仅一个染色体的探针，则探针混液组成为 IyL 探针、2pLHPLC 级纯水和 7pL 杂交缓冲液。对于 CEPX 和 CEPY 探针混合物，将探针和 CEP 杂交缓冲液振荡并离心。10/xLCEPX 和 CEPY 探针混合物工作液组成：I1^LCEPX. 和 CEPY 的探针混合物、2 斗 HPLC 级纯水和 CEP 杂交缓冲液。

3.MdtiVysion 的 5 色探针混合物是可以直接使用。用前先离心，振荡混匀。所有的探针混合物工作液都可以-20℃保存几个月（在厂家提供的有效期内)。

杂交程序

1.杂交前，先用金刚石笔将 22 mmx30 mm 的盖玻片切成 8 mmx8 mm 的小块，放在有盖的玻璃培养皿内备用。

2.封口膜剪成约 22 mmx22 mm 大小，放在皿内备用。

3.准备杂交湿盒：用消毒过的水浸湿纸巾后放入一玻璃皿内，再放一玻片架，加盖后放于 37℃ 温箱预温备用。

4.从-20℃取出要杂交的探针混合物工作液，离心 10s 后振荡混匀。

5.用微量移液器将 2uL 探针混合物工作液加于玻片上标记好的染色质区域后，迅速用镊子将 8 mmx8 mm 盖玻片盖上，注意不要有气泡而影响杂交。若出现气泡，用镊子轻压盖玻片将气泡赶出。

6.用橡皮泥或封口膜将盖玻片封口。用封口膜时要注意压下盖片周围，以确保封口膜都粘在玻片上（见注释 2)。

7.将玻片置于 69℃ 的玻片电热板上 8 min，使探针和标本 DNA 同时变性。

然后将玻片标本迅速移到 37℃ 温箱预热的湿盒中进行杂交（见注释 3 和 4)。

洗脱步骤

以下是我们实验室常用的两种洗脱步骤，无需甲酰胺且省时。

快速洗脱程序 I

该洗脱程序适合 1~3 种颜色的探针混合物和 MdtiVysionPGT(13、18、21、X 和 Y 染色体)。

1.将装有 0.4xSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 溶液的染色缸放入 73℃水浴中预热，在对标本洗脱之前用校准过的温度计检查缸内的温度，溶液温度应为 (73±1)℃。

2.准备一缸 2xSSC/0.l%NP-40(pH7.4) 溶液，放置于室温下备用。

3.揭掉盖玻片后立即放入 0.4xSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 中，当所有的标本（同一染缸最多放 4 张玻片）放入后洗脱 5 min。

4.将标本移入装有 2XSSC/0.1%NP-40(pH7.4) 液的染色缸中室温洗脱 1min。

5. 从洗脱液中取出标本于 HPLC 级纯水中浸泡一下，将标本垂直立于暗处 (如抽屉中）纸巾上晾干。

快速洗脱程序 II

该洗脱程序适用于 MultiVysionPB(极体）探针组合，包括 13、16、18、21 和 22 号染色体探针。

1.将装有 0.7XSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 溶液的染色缸放入 73℃ 水浴中预热，在对标本洗脱之前用校准过的温度计检查缸内的温度，溶液温度应为（73±1)℃。

2.准备一缸 2XSSC/0.1%NP-40(pH7.4) 溶液，置于室温条件下备用。

3.揭掉盖玻片后立即放人 0.7XSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 中，当所有的标本（同一染缸最多放 4 张玻片）放入后洗脱 7 min。

4.将标本移入装有 2XSSC/0.1%NP-40(pH7.4) 溶液的染色缸中室温洗脱 1min。

5. 从洗脱液中取出标本于 HPLC 级纯水中浸泡一下，将标本垂直立于暗处 (如抽屉中）. 纸巾上晾干。

DAPI 复染

1.每一玻片加 10juLDAPI/抗淬灭混合液于杂交区，盖上 22 mmX30 mm 的盖玻片。

2.用纸巾或吸墨纸使溶液均匀分布和吸去玻片上多余的液体（对于 MultiVysion5 色探针混合物，配有不含 DAPI 的专用复染液)。

四、信号评估

1.杂交信号在 600 倍的荧光显微镜油镜下观察。由于荧光信号见光易淬灭，为减少突光衰减，所有含焚光素的液体操作，包括杂交后标本的处理步骤都应在弱光下进行。对所有不需要光线的步骤（包括杂交温育及洗脱过程）都应避光进行（见注释 2)。

2.荧光显微镜用 100W 的汞灯激发，尽管制造厂家推荐汞灯的寿命至少有 200 h，但我们发现使用 175 h 后镜下的杂交信号变弱造成误诊。应有备用汞灯灯泡。

3.MuItiVysionPGT 的多色探针组合中，X 染色体的信号为蓝色，Y 为金色，13 号染色体为红色，18 号为浅绿色，21 号为绿色（见注释 7 和 8)。

4.MdtiVysionPB 极体专用的多色探针组合中，13 号染色体的信号为红色，16 号为浅绿色，18 号为紫蓝色，21 号为绿色，22 号为金色（图 1)(见注释 7 和 8)。

5.通过与探针标记的荧光素相应的单通道滤光片观察到信号（红、绿、蓝、金、浅绿色及 DAPI)，双通道或三通道的滤光片只适合于鉴别非特异荧光信号或记数着丝粒探针信号常见的信号渗透，后者探针杂交于 a 卫星重复序列，信号大而亮（见注释 7)。

6.确定信号数目时，应注意每个信号的大小和亮度，尤其是当两个信号比较接近时。鉴别 13、21 和 22 号染色体是用位点特异性探针，其中包含要研究染色体的同源序列和未标记的封闭 DNA 抑制共同序列。与计数 16、18、X 和 Y 染色体着丝粒的探针（与大量的《卫星重复序列杂交）相比，特异序列探针信号为小圆点（见注释 6 和 7)。

7.对于距离比较近相互搭在一起甚至相互重叠的不同染色体信号，如何与非特异杂交信号进行鉴别，建议同时用单通道和双通道滤光片仔细观察。在图像上，不同颜色的信号重叠部分由于颜色组合可显示黄色或白色（见注释 7 和 8)。

当用三色及以上的探针组合时，强烈推荐用图像分析系统进行分析。

8.PBl 中每条染色体含两个染色单体，每一染色体应有两个大小相同的信号，一般两信号的间距应大于一个信号的直径（图 1 中 A、C 和 E)。但如果两个染色单体距离近，信号可能连在一起，像一个荧光小带（图 IE 中所示的 PBl 中 16 号染色体信号），代表两条染色单体（见注释 6 和 9)。

9.PB2 中每条染色体含单个染色单体，因此每一检测的染色体呈现一个荧光信号（图 1 中 A、C 和 E)。

10.正常情况下，在每个卵裂球核中要研究的染色体信号为两个单点信号 (图 1 中 B、D 和 F)。但由于不同的细胞周期阶段、染色体的浓缩及铺散程度不同，染色体信号可显示为双点信号。复制后，每一条染色体的信号可显示为距离小于一个信号直径的成对的信号点，或者是两个相互搭在一起的小带，按分析标准这两种情况都应记为一个信号（见注释 7 和 8)。

11.如果两信号点的大小及亮度都相等，且两者之间的距离大于两个信号的直径，则计为两个独立的信号。但染色质髙度浓缩核的两个独立信号间的距离也可能小于两个信号的直径，必须注意考虑这种情况以免误诊。每一个核信号的大小和亮度应与同一玻片上的其他核进行比较，以区分真正的信号和非特异信号。

荧光强度弱、小或平面无焚光外观的杂交点不在计数之列（见注释 6 和 7)。

注释

1.在做杂交前，必须将卵裂球、PB 和 PB2 的染色质完全暴露、无残留的细胞质并牢固在玻片上。因此在加探针之前，极体或卵裂球标本还应进行预处理以保持形态和去掉残留的细胞质。胞质残留是通过核酸复性过程影响杂交的最大因素，可导致非特异荧光信号影响结果判断，这是需要克服的重要问题。染色质暴露的不充分和胞质残留可在杂交后显示非特异的荧光信号，使得信号判断困难甚至无法分析。

2.FISH 涉及的所有操作步骤（包括固定）的标准化和质控监测，对杂交信号的质量和解释是至关重要的。为确保特异性，每一批标本都应有对照淋巴细胞标本同时进行杂交。，

3.依据所用杂交探针种类的不同，杂交时间可从 2 h(着丝粒探针或特异序列探针）到 16 h(全染色体涂染探针或亚端粒探针）不等。用 MdtiVysicm 探针组合，不用 DAPI 复染，杂交时间在 3 h 内。若杂交时间太长，探针混合物中用 aqua 标记的胎盘 DNA 会使染色质产生很强的背景。建议卵裂球的 MultiVysion 探针杂交时间不超过 2 h，极体的 MultiVysion 探针杂交时间不超过 3 h。

4.Vysis 公司的 Hybrite 杂交装置可代替玻片电热板和温箱同时对核酸变性和杂交（一次最多可做 12 张玻片）。从变性（69℃、8 min) 到杂交（37℃、3~16 h) 都是程序化控制。沿玻片电热板在每个槽中都加几微升的水，以保证潮湿的环境，对过夜杂交尤其重要。在玻片上加探针，盖上盖玻片并用封口膜封片后就可以放人 Hybrite 杂交装置。盖上盖子，启动程序，不要动标本直到杂交过程结束。在启动程序前用玻片温度计监测如融解温度是否准确，来确定功能的正常使用。

5.如果 PBr 固定效果不好，有胞质残留，探针核酸可能无法接触到固定标本的核酸造成杂交失败。如果形成新的杂交，信号可能会很弱和（或）散成多个点，这种情况多见于过度退化的第一极体。染色质固定不足加上细胞残留物可能导致杂交后的非特异荧光，使得信号判断困难甚至无法分析。

6.尽管所有条件都按标准控制，但有时一个探针或多个探针的信号会较弥散甚至散成多个点，这样的结果分析起来较复杂。这种情况通常是染色质退化所致。当信号弥散或分离时，一定要同时考虑检测 PBl 和 PB2 的信号质量。

7.非特异杂交在两个或以上的滤光片下都能看见，位置不变，但通常较弱。当探针荧光信号特别强时，可在其他滤光片下观察到渗透的信号，但信号通常较弱且无立体感。一般出现这种现象的都是信号较强且弥散的 CX 卫星重复序列探针。

8.用适当的单通道或双通道滤光片可以排除强的非特异杂交。如果卵裂球核周胞浆去除干净而没杂交信号，同一玻片上其他核有信号，应考虑卵裂球异常。这种情况并不少见，尤其是当核大小差异明显或核片段化时。

9.在评价 PBl 荧光信号中，考虑到受精后的移出（如回收后 24 h)，代表每一个染色单体的信号可能进一步分开，因为染色单体随时间延长而分离。这些预先分离的信号视为正常，信号数较易确定（见图 IA 中 PBl 中的 22 号染色体金色信号以及图 IE 中 PBl 中的 18 号染色体信号)。

10.用 FISH 技术对卵裂球、PB1、PB2 进行植人前非整倍体诊断具有很高的准确性和可靠性。这已通过对预期异常的全胚胎的确证研究和大约 2000 个 PGD 周期的 500 个以上临床妊娠的随访性细胞遗传学检测结果得以验证。