目的基因的PCR扩增
实验概要
进行目的基因的PCR扩增
实验原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括3个基本步骤：⑴变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；⑵退火：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；⑶延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这3个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
主要试剂
Taq酶
相应引物
dNTP等
实验步骤
1.PCR反应
(1) 所用溶液融化后置于冰上。
(2) 依次混匀下列试剂：
25μl 10×PCR buffer
15μl 25mmol/L MgCl2
25μl 4种dNTP
5μl 引物1
5μl 引物2
124μl ddH2O
1μl Taq 酶
混匀后离心5秒种。
(3) 分成10管，每管各加5μl模板DNA（约1ng），编号。
(4) 混匀后离心5秒种，PCR扩增。
(5) 参数设定
T (℃) | Duration | Cycle |
94 | 2 min | 1 |
94 | 0.5 min |
30 |
55-60 | 0.5 min | |
72 | 1 min | |
72 | 10 min | 1 |
4 | 2 hr | storage |
2. 电泳
取10μl扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
注意事项
1. PCR反应非常灵敏，操作应尽量在无菌操作台中进行。
2. 吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要相互污染试剂。
3. 试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
