实时荧光定量PCR技术-2
qRT-PCR
基因表达分析
在384孔板上11ul/孔的总反应体积中，使用荧光Universal ProbeLibrary（UPL）探针（罗氏公司）和ABI 7900HT 实时仪器（美国应用生物系统公司）以及2X FastStart Universal Probe Master （Rox）PCR试剂（罗氏公司）进行定量RT-PCR。每次反应的 cDNA/RNA浓度为10ng。ABI 7900HT实时仪器（美国应用生物系统公司）的PCR条件如下：+95℃下变性15分钟，+95℃下扩增15秒，最后在+60℃下延伸60秒。
miRNA定量
使用LightCycler® 480实时荧光PCR仪（罗氏公司）， 在384孔板的模式下，设定反应体积为20ul，以1:10梯度稀释cDNA，在miRCURY LNA SYBR Green master mix，miRCURY LNA内源性对照SNORD44和miR-21的LNA PCR引物（Exiqon）的共同作用下进行miRNA qRT-PCR. LightCycler® 480仪的PCR条件如下： 95℃变性10分钟， 95℃变性10秒，60℃延伸20秒，反应设40个循环。使用△△Ct方法（Livak 和Schmittgen，2001年），用HPRT1和GAPDH作为参考（管家基因）基因，来反映假定的靶向基因表达水平上的成倍变化。对于has miR-21，则用非靶向合成类似物-和抑制剂-miRIDIAN作为miRNA转染HeLa细胞的实验对照。
3 结果和讨论
为了分析miR-21水平升高对靶向基因（PDCE4，PTEN和TLR2）的mRNA水平的影响，我们使用UPL通用探针库探针（罗氏公司）和ABI 7900HT实时PCR仪（美国应用生物系统公司）对已经报道的能够被miR-21调控的一些mRNA的丰度进行了定量测定。使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），用miR-21的类似物和抑制剂对HeLa细胞进行转染，并分别设置（miRNA 21 miRIDIAN类似物对照，miRNA miRIDIAN类似物对照，miRNA 21抑制剂和miRNA抑制剂对照siRNAs）。miRIDIAN miRNA类似物是一种合成的双链结构，能够代表对靶向mRNAs进行调控的成熟miRNAs，与内源性miRNAs类似。与之相反，miRIDIAN miRNA抑制剂是一种不可水解的成熟miRNA的反向互补单链，在转染细胞之后能够降低内源性miRNAs的活性。这极有可能是由于抑制剂与成熟miRNA之间进行不可逆结合造成的（Meister, Landthaler等，2004）。
我们在LightCycler® 480（罗氏公司）上进行qRT-PCR，对miR-21的miRIDIAN类似物和抑制剂对成熟miR-21水平的影响进行了定量测定。使用High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司）提取miRNA，用qRT-PCR与miRCURY LNA进行定量检测，并用小分子量非编码核仁RNA SNORD44进行校准。与用miRIDIAN类似物处理的对照细胞相比较，用50nM miR-21的miRIDIAN类似物转染细胞后，HeLa细胞中miR-21的浓度上升了7.3倍（见图3）。与之相反，用50nM miR-21的miRIDIAN抑制剂转染HeLa细胞后，miR-21水平下降了77%（见图3）。这表明，X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司）是一种非常好的转染工具，能够有效地将miRIDIAN类似物和miRIDIAN抑制剂转染到目标细胞中。而且我们还发现，High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司）能够有效地提取miRNA，并用于之后miRNA浓度的分析。
在使用miRIDIAN类似物和抑制剂上调和下调细胞内miR-21浓度之后，我们对miR-21公认的靶向mRNAs（PDCD4， PTEN 和TLR2）的表达水平进行了研究。在用miR-21的类似物和抑制剂以及各自的对照物感染HeLa细胞两天之后，用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司）提取总RNA。在ABI 7900HT（美国应用生物系统公司）上使用qRT-PCR和UPL通用探针库探针对mRNA水平进行定量测定，并与对照基因（管家基因）HPRT1和GAPDH正常的基因表达水平进行比较。我们发现，与对照组相比，miR-21的过度表达导致PDCD4（编码人致瘤性转化抑制物）的mRNA水平显著下降了29%（见图4）。最近的研究发现，mi-R-21过度表达能够在蛋白质水平和mRNA水平上对PDCD4基因造成影响（Frankel，Christoffersen等人，JBC，2008，283），该实验的结果进一步证实了这一发现。
与之相反，在PTEN 的mRNA（编码人同源性磷酸酶-张力蛋白）水平上没有观察到miR-21的影响。在上调或下调miR-21水平之后都是这种情况（见图5）。最近的研究发现miR-21能够通过影响翻译过程而在蛋白质水平上对PTEN产生影响，而PTEN mRNA水平则不发生变化（Wickramasinghe 等人，2009，NAR）。我们的研究与这一发现相符。有意思的是，与抑制剂转染对照细胞相比，在用miR-21抑制剂转染细胞之后，TLR2（编码toll样受体2）mRNA水平显著下降了57%（见图6）。miR-21和TLR2都在细胞凋亡调控过程中发挥作用，TLR2可能是miR-21抗细胞凋亡活动的重要介质。TLR2是miR-21活性的直接还是间接靶向基因尚不清楚，仍有待研究。
4 结论
在该研究中，我们分析了hsa miR-21对三个公认的靶向基因（PDCD4，PTEN 和TLR2）在mRNA表达水平上的影响。人miR-21应答通过外源性miRNA miRIDIAN类似物和抑制剂（Dharmacon）进行调控，使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司）能够轻松实现类似物与抑制剂向HeLa细胞的转染过程。
为了分析miR21水平，罗氏公司的High Pure miRNA Isolation Kit为之后进行qRT-PCR扩增提供了高质量的模板。该扩增过程用miRCURY LNA First-strand cDNA试剂盒，miRCURY LNA SYBR Green Master Mix，miRCURY LNA内源性对照SNORD44和LNA miR-21 PCR引物（Exiqon），在LightCycler® 480实时荧光PCR仪（罗氏公司）上进行。
为了对假定目标基因进行基因表达分析，我们在工作流程中使用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司）进行RNA提取，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（罗氏公司）进行逆转录，并用通用探针库探针UPL和FastStart Universal Probe Master（Rox）试剂（罗氏公司）和ABI 7900HT（美国应用生物系统公司）在调控细胞内miRNA之后对mRNA水平进行定量测定。
综上，该基因表达分析的工作流程程序易于建立，并且足够灵敏，能够检测到由一般miRNAs引起的mRNA水平的细微变化，适合相关miRNA表达调控研究的参考。
参考文献
1. Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25, 402-408.
2. Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y. and Tuschl, T. (2004) Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA, 10, 544-550.
3. Frankel, L.B., Christoffersen, N.R., Jacobsen, A., Lindow, M., Krogh, A. and Lund, A.H. (2008) Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem, 283, 1026-1033.
4. Wickramasinghe, N.S., Manavalan, T.T., Dougherty, S.M., Riggs, K.A., Li, Y. and Klinge, C.M. (2009) Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res.
X-TREMEGENE，LIGHTCYCLER，HIGH PURE和FASTSTART为罗氏公司商标。
ProbeLibrary和 LNA是丹麦Vedbaek Exiqon A/S公司的注册商标。
SYBR是分子探针有限公司的注册商标。
miRIDIAN是Dharmacon公司的商标。
其他商标或产品名称为其各自所有者的商标。
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