使用UPLC/MS/MS分析血清中的25-羟基维生素D（二）

校准品和QC标准品
按照各个生产厂家的说明制备单一浓度的校准品和双浓度水平的QC标准品(Chromsystem，德国慕尼黑)。通过混合人血清并加入已知浓度的25OHD2和25OHD3，制备低浓度QC标准品溶液。低、中和高浓度QC样品中25OHD2的最终浓度分别为19、27和84ng/mL，25OHD3的最终浓度则分别为13、29和89ng/mL。使用哺乳动物血清制备校准品用以线性评估，其中25OHD2和25OHD3的浓度范围为1-100ng/mL。在264 nm下检测储备液，然后将其调整至最终浓度。 

样品制备
吸取血清(150μL)至2mL微量离心管(Anachem)中，加入10μL内标(250ng/mL六氘代25OHD3，合成AS，以80%甲醇/20% IPA为溶剂) ，涡旋混合(10s)。加入0.2 M ZnSO₄溶液(150μL)并涡旋混合(10s)以增强反应 。加入甲醇 (300μL)并混合(10s)，以沉淀血清中存在的蛋白质。加入己烷(750μL)，用以提取25OHD。混合30s，然后将样品在13000rpm下离心5 min。移取己烷层并将其置于沃特世最大回收样品瓶中，在50˚C的氮气下蒸发至干。将样品复溶于75μL70%甲醇水溶液中，借助ACQUITY样品管理器的预加载功能将20μL样品注入UPLC/MS/MS系统中，进样间隔时间为6 min。

离子抑制
将人血清样品混合低浓度的25OHD2和25OHD3并使用柱后添加对其进行分析，以100ng/mL浓度和10μL/min流速通过ACQUITY TQD集成式样品流路。 

结果线性
使用QuanLynx定量软件和ApexTrack^TM积分算法进行数据处理 。以2.5-100ng/mL的浓度范围内向血清中加入已知浓度的25OHD2和25OHD3，对分析方法的线性进行考察。25OHD3的确定系数(R2)>0.999(图2)，计算所得的校准品浓度均在指定值的±4%范围之内。 25OHD2的确定系数(R2)>0.997(图3) ，计算所得的校准品浓度均在指定值的±10%范围之内。

图2 .血清中25OHD3的校准曲线。

图3 .血清中25(OH)D2的校准曲线。 

准确度
通过分析购自DEQAS(www.deqas.org)的外部质量控制样品考察分析方法的准确性。利用Chromsystem单点校准品绘制出一条过零点的校准曲线，用以计算DEQAS样品浓度。采用Passing-Bablok线性回归(Microsoft Office Excel 2003，带Analyse-It插件1.73版)将Waters 25OHD3的结果与通过DEQAS LC/MS方法所得的结果平均值进行对比。所有结果均在预期值的±11.5%偏差范围之内(图4)。

图4 .将Waters 25OHD3结果与DEQAS LC/MS方法所得的结果平均值进行对比的Passing-Bablok线性回归分析。