自动化的微流控芯片系统在单细胞中检测MicroRNA的异质性1
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Fluidigm 公司开发了一种在C1TM单细胞自动制备系统及BiomarkTM HD系统上检测单细胞miRNA表达谱的实验方案。此方案可以在小于24小时的时间内，平行处理96个单细胞，在一张GE 96.96芯片对每个单细胞分别检测多达96种miRNA。配套的SINGuLAR™ 2.0分析软件可以对数据进行非监督式聚类分析及PCA分析，有效的根据miRNA表达类型在单细胞水平揭示细胞群体的异质性，为研究miRNA调控提供更多数据。
使用自动化的微流控芯片系统在单细胞中检测MicroRNA的异质性
Leyrat Anne, Shuga Joe, Li Nianzhen, Szpankowski Lukasz, Unger Marc & West Jay
（ISSCR 2013 poster: F-3201）
介绍
MicroRNA (miRNAs)是一类短小（18-24个核苷酸）的非编码RNA，它们可以通过破坏信使RNA（mRNA）的稳定性和抑制mRNA翻译来调控基因表达。细胞群体中miRNA的表达通常认为可以驱动下游基因表达和蛋白功能。我们的目的是使用一种微流控系统在单细胞水平确定miRNA表达的变化，这种系统可以自动化的将单细胞捕获及miRNA预扩增以便进行后续表达分析。我们开发了一种简单、模块化的流程，可以将对细胞群体的分析轻松降至单细胞水平（图1）。此流程包括两个核心部件：C1TM单细胞自动制备系统（图1a：样本制备，包括细胞分离和从miRNA制备cDNA）和动态芯片（Dynamic Array™ IFC）及BiomarkTM HD系统（图1b：读出，高度平行的表达分析）。对C1TM芯片捕获的每个单细胞进行的目标特异性扩增（Specific Target Amplification, STA），借用了Single Cell-to-Ct™试剂盒(Life Technologies)完成裂解及预扩增步骤，以及TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 试剂盒(Life Technologies)完成逆转录步骤（图2）。
使用动态芯片及BiomarkTM HD系统，可以使用96对microRNA
TaqMan表达引物，平行分析从96个单细胞预扩增所得的96个cDNA样本。使用Fluidigm SINGuLAR™
2.0分析软件对数据进行主成分分析（Principal Component
Analysis，PCA），揭示了从单一表型所得的一群单细胞中miRNA表达的显著变化（图3,4,5）。比较不同表型的细胞群体（人类胚胎成纤维细胞，人类诱导多能干细胞（iPS），从iPS所得人类神经祖细胞（NPC），以及完全分化的人类神经元（HN）），除同一类细胞之间表达的异质性外，展示了(不同类型细胞间)更巨大的差异。
结果
图1. 在单细胞进行miRNA分析的整合流程
C1单细胞自动制备系统使用Life Technologies 开发的试剂和实验方法（“Single-cell
MicroRNA expression
analysis”），对单细胞中的miRNA转录本进行目标特异性扩增（STA）。从将细胞悬液加至C1芯片到完成数据分析的整个流程，可以在不到24小时内完成。
图2. C1 MicroRNA STA实验流程
单细胞悬液（200-1000个细胞）被加入C1 IFC芯片的细胞进样孔。使用来自Single Cell-to-Ct™试剂盒(Life Technologies)的裂解和预扩增试剂，以及来自TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription 试剂盒(Life Technologies)的逆转录试剂，进行逆转录（使用MegaplexTM RT pool）和预扩增（使用MegaplexTM PreAmp pool)，以便可以检测每个单细胞中多达380种miRNA的表达。C1 IFC捕获单细胞，然后冲洗，裂解，在反应仓平行对每个单细胞的miRNA进行逆转录和预扩增。96个预扩增过的样本然后被导出，使用Biomark HD系统在一块96.96动态芯片运行，研究每个样本中多达96种miRNA的表达。
