免疫PCR[Im-PCR, Immuno PCR]基本原理、试验程序和操作方法-2
4DNA和PCR系统
免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上，一般是一个分子DNA标记两个生物素，标记率可达百分之百。生物素化的
DNA用量需预先选定，过多易出现非特异结合而引起本底过高，过低将导致敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。
免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热
DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为固相必须有配套的PCR仪，以使可以用微量板直接扩增，否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。
三、主要程序
（一）抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；
（二）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；
（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；
（四）PCR扩增生物素化DNA部分。
四、制作方法
（一）制备生物素化DNA
将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280bp DNA片段，即为生物素化DNA。
（二）免疫PCR模式
1 试剂
包被缓冲液:20mmol/L Tris-HCI(pH9.5)，含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗涤液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀释液:20mmol/L Tris-HCI(pH7.5)，含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1)包被
用包被缓冲液稀释抗原(BSA)，加入微滴板中(45μl孔)，4℃过夜 (约15h)，用洗涤液洗板3次×5min。
2)封闭:
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA(1mg/ml)、 0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5)(含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。
