PRIMO冷冻电镜在标准化细胞观察的应用（二）

图 4. （ j-k 图）：冷冻电镜图像：分别是（图 3， h 图）中 P1 和 P2 两个位置的断层扫描切
片。
根据十字弓形状的 RPE1 细胞的肌动蛋白图谱（ actin map），在预期的位置发现了大致等同
于肌动蛋白横向弧（ actin transverse arcs）（与细胞边缘平行但有一定距离）的肌动蛋
白束（ actin bundles）和在（图 3， a 图）中显示的内部应力纤维（ internal stress fibers）
【 2】。

（四） 电镜网格表面无损伤

因为 PRIMO 是无掩模和非接触式光刻系统，它可以将您要的微图案用 UV 光投射到电镜
网格的表面，而不会损伤网格的完整性。


图 5. 用 PRIMO 系统对电镜网格进行无掩模的光照图案化（ photopatterning）操作【 3】：
在金电镜网格上加上一层多孔碳膜，在多孔碳膜上包裹一层防污涂层（ PLL-g-PEG，聚 L 赖
氨酸-g-聚乙二醇），阻碍蛋白质粘附。加入 PLPP 光引发剂，通过 PRIMO 的非接触式、无掩
模的光刻技术，用 UV 光将图案投射到碳膜上，防污涂层被降解，蚀刻出微图案， ECM 蛋白
可粘附在蚀刻出的微图案上，细胞再粘附在蛋白上。整个过程对电镜网格无损伤。


图 6. 左侧（ a 图）：用 PRIMO 无掩模光照图案法（ photopatterning）得到的，在多孔碳电
镜网格中的 ECM 蛋白微图案。电镜网格为 200 目的金格栅条，比例尺为 50µm。
右侧（ A-I 图）：上皮 PtK1 细胞，被限制在电镜网格中的罗丹明-纤维连接蛋白（红色）组
成的微图案上，该微图案由 PRIMO 无掩模光照图案法得到。比例尺为 10µm。【 3】
（五） 什么是 PRIMO？

5.1 PRIMO 的原理

法国 Alveole PRIMO “ 定制化细胞微环境制备系统” 是创新性定制细胞模型的工具，
能在微米级别的尺度下，以具有超高灵活度和再现性的生物工程手段实现体外微环境的定
制，同时可对其机械力学和生化特性进行设计微调。


图 7. 左图：选择电脑中任意一张图案，在 LEONARDO 软件作用下，用 PRIMO 进行非接触式、
无掩模 UV 投射和蚀刻。 PRIMO 模块和大多数倒置显微镜兼容。右图： PRIMO 通过控制 DMD
（ Digital Micromirror Device），即 DLP chip 的微型镜片的开合状态，控制投射在细胞
基质上的 UV 光的照射强度、照射时间和照射区域，按照图案进行灵活蚀刻【 4】。
PRIMO 的微图案法（ Micropatterning）的实验原理可参考： 生物建模的黑科技——快
捷精准的“定制化细胞微环境制备系统”（上）。

5.2 PRIMO 的主要特点和优势【 4】：

⚫ 无掩模： 非接触式、无掩模 UV 投射成像（波长λ =375nm），可灵活控制 UV 的强度、照
射时间、区域；
⚫ 自动化： 全自动快速定制，可针对实验条件进行快速优化；
⚫ 高灵活性： 可按照任意图案去构建您的基质和/或使其功能化，不限图案的大小和复杂
程度，生成不同的细胞模型；
⚫ 多样性/兼容性： 适用于常规的细胞培养基质，基质可为平面或有微结构，可硬可软，
如：玻璃盖玻片、塑料培养皿、聚二甲基硅氧烷（ PDMS）、聚苯乙烯、水凝胶（ PEG 丙
烯酸酯、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂、基质胶）、光刻胶，等；
⚫ 常 用 蛋 白 ： 我 们 的 客 户 日 常 使 用 超 过 10 种 的 各 类 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体，等；
⚫ 高分辨率： 全视野分辨率为 1.2µm（ 500× 300µm ， 20 倍物镜）；
⚫ 多层次： 可蚀刻 256 个灰阶层次，粘附不同密度层次的蛋白；
⚫ 多种蛋白： 可应用 3 种不同蛋白（根据实验需求）；
⚫ 自动对齐： 自动进行检测和图案定位，可自动对齐于微结构或者微图案上；
⚫ 速度快： 蚀刻 500× 300µm 图案， 20 倍物镜，仅需 30s。

5.3 PRIMO 的应用领域

PRIMO 强大的生物建模能力和对细胞微环境的控制，可以为多种生物学实验带来全新
的、突破性视角，可用于研究细胞迁移/趋触性、细胞黏附、 2D/3D 细胞标准化培养、细胞
球培养、生物力学、组织工程、微流体芯片，等多个领域【 4】 。

参考文献：
【 1】 Alveole 的官网：
https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
【 2】 M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by
photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 2019,
https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5.
【 3】 L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell
cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and
Microengineering, 29 (2019) 115018 (9pp),https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a
【 4】 Alveole 的官网： https://www.alveolelab.com/