绿色荧光蛋白在信号转导中的应用

　　新近研究发现，某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer,FRET）。FRET 是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。FRET 发生的前提条件是，荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内，则非常利于 FRET 的产生。因为 FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 （在纳米范围内）。

　　两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。由于 FRET 能量转移并非是 100 % 的效率，一个实用而有效的检测 FRET 的方法是，仅仅激发荧光供应分子，然后计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率。比值的变化是一个理想的观测细胞动态变化的指标。因为它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物探针，现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应的 FRET。

　　研究发现可以通过调节 GFP 来改变 FRET。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上，并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子,这两个 GFP 恰好可以发生 FRET，当加入蛋白酶时，间隔子被切除，两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变，FRET 被完全阻断。该实验提示我们，可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子，来动态观测活细胞的生理功能。

　　在上述实验基础上，研究人员开始设计 FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂，其设计原理是，钙调蛋白 (CaM) 通过肌球蛋白轻链激酶(MLCK) 结合到 CaM 结合区。蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白通过 CaM 和 MLCK 区域融合在一起，当 Ca 2 + 增多时，形成更多的 Ca 2+  -CaM 复合物，并从 MLCK 结合到 CaM 结合区域。该实验发现，通过改变两个 GFP 之间的距离，可以增加 FRET。另有一些研究人员，并没有把两个 GFP 融合在一个单一结构中，而是把一个 GFP 融合到 CaM 上，另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域。结果发现，当 Ca 2+ 结合到 CaM 上，出现分子间异源二聚体，两个 GFP 足够接近而产生 FRET。这个实验提示了一个非常重要的现象，即 FRET 不仅可以在分子内发生，而且还可以在分子间发生。

　　最近，有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学，通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞，观测有关 cAMP 的动态荧光变化。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位，设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时，两个荧光分子距离很近，并出现 FRET，如果增加 cAMP 浓度，发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法，可以检测出 cAMP 的动态变化,并开创了在整体条件下，研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。

　　GFP 的结构虽然具有高度完整性，但是实验中发现，在 GFP 中某些确定的位置，插入外源基因，完全没有丧失其荧光性。当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中，得到 Ca 2+ 传感器，当 Ca 2+ 结合到 CaM 上，导致生色团去质子化，使荧光强度增加 7 倍。当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指结构，可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP，结果发现荧光少量增加，为改变前的 1.7 倍，K d 值约 0. 4mmol。插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现象，提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。