固相化 pH 梯度双向凝胶电泳实验9
方案9 胶体考马斯亮蓝染色实验
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固相化 pH 梯度双向凝胶电泳实验
双向凝胶电泳
蛋白质 固相化pH 蛋白质与蛋白质组学实验指南 第四章
双向电泳是研究蛋白质组学的一种有效方法。与单向电泳相比，它能从复杂的蛋白质混合物中分离出更多的成分。电泳时，蛋白质迁移速度取决于它们的分子形状、大小及所带电荷多少，双向电泳利用后两项特征使蛋白质能够有效分离。
[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编 何大澄 主译
方案1 双向凝胶电泳鼠肝蛋白质提取物的制备实验
方案2 双向凝胶电泳真核生物细胞裂解物的制备实验
方案3 双向凝胶电泳大肠杆菌裂解液的制备实验
方案4 双向凝胶电泳脑脊液蛋白样品的制备实验
方案5 第一向：蛋白质的等电聚焦电泳实验
方案6 垂直 SDS 平板凝胶的制备：均一凝胶的灌制实验
方案7 垂直SDS 平板凝胶制备：同时灌制多梯度凝胶实验
方案9 第二向：蛋白质的 SDS-PAGE 实验
方案10 胶体考马斯亮蓝染色实验
方案11 银氨染色
方案12 与质谱兼容的银染法实验
方案13 用 SYPRO Ruby 进行荧光染色
方案14 用 GelCode 磷蛋白染色试剂盒对磷蛋白进行染色实验
方案15 双向凝胶的槽式转移实验
方案16 双向凝胶的半干印迹实验
方案17 用丽春红 S 染色膜上的蛋白质
方案18 用考马斯亮蓝 R250 染色膜上的蛋白质
方案19 用印度墨水染色膜上的蛋白质
方案20 用胶体金染色膜上的蛋白质
| 实验方法原理 | 此方案是在对 Neuhoff 等的方法进行修订的基础上建立的（1988)，包括考马斯亮蓝 G250 和蛋白质的结合。考马斯亮蓝 G250 可以结合碱性氨基酸如精氨酸、酪氨酸、赖氨酸和组氨酸，染料的胶体特性使产生的背景非常低。这一特性可以阻止考马斯亮蓝渗透凝胶，避免考马斯亮蓝 R250 染色时较长的脱色过程。胶体考马斯亮蓝通常用于染色凝胶，检测范围为 8~50ng。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.将凝胶置于玻璃或塑料培养皿中固定，轻轻摇动至少 1h。 可将凝胶固定过夜。如果凝胶有标记，多个凝胶可在同一培养皿中固定，固定液的体积应足够大，以使所有凝胶都能自由移动。 2.移走固定液，在摇床上用水清洗凝胶 10 min。 3.弃去水，重复洗 2 次。 4.在洗第三次时，将 4 份考马斯亮蓝储备液和 1 份甲醇混合，以制备胶体考马斯亮蓝染液。 5.将凝胶放在 100~300 ml 胶体考马斯染料内（染料的体积依胶的大小而定，确保染料覆盖凝胶）。在往复式或定轨式摇床上，轻摇过夜。 凝胶应在染料中放置足够长时间，其颜色会持续加深一直到第七天。 6.去除残留染料，将凝胶转移至盛有 45~55°C 双蒸水或去离子水的干净平皿中。 当水变色时弃去，再次用新的 45~55℃的 H2O 轻轻摇晃清洗凝胶。重复几次，直到蛋白质带较凝胶背景变得明显，蛋白质将在清晰的背景上出现蓝色。 7.凝胶可用于扫描分析。扫描湿凝胶较好，因为若凝胶干燥易破裂，导致数据的丢失。 8.在干燥之前，将凝胶浸在 5% 甘油中 30 min，凝胶也可装在密封塑料袋内，储存于 4°C。 展开 |
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