分子生物学产品常见问题分析
分子生物学产品常见问题分析 |
| 问题原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割1) 内切酶失活标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3) 条件不适（试剂、温度）检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增6) DNA位点上存在其它修饰将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证7) DNA不存在该酶识别顺序换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证DNA切割不完全1) 内切酶活性下降用5-10倍量过量消化2) 内切酶稀释不正确用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3) DNA不纯，反应条件不佳同上4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰同上5) 部分DNA溶液粘在管壁上反应前离心数秒6) 内切酶溶液粘度大，取样不准将内切酶稀释，增大取样体积7) 酶切后DNA粘末端退火电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡9) 过度稀释使酶活性降低适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10)反应条件不适使用最佳反应体系11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序加大酶量5-10倍DNA片段数目多于理伦值1) 内切酶星状活性检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2) 其它内切酶污染用λDNA作底物检查酶切结果3) 底物中含其它DNA杂质电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段酶切后没有观察到DNA片段的存在1) DNA定量错误（如RNA含量较高）用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次内切酶保存期内快速失活1) 保存温度不合适内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存2) 以稀释形式保存稀释酶液不宜长期存放，应一次使用3) 贮藏缓冲液不适当使用厂家推荐的贮藏缓冲液4) 低蛋白浓度内切酶与500ug/ml的BSA一起保存电泳后DNA片段的带型弥散，不均一1) DNA上结合有蛋白质电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化2) 内切酶中含有DNA外切酶减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶酶切后的DNA片段连接效率低1) 含磷酸盐的浓度高透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2) 内切酶失活不全或含有ATP酶延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3) 平末端连接加大T4 DNA Ligase用量4) 外切酶污染减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA5) 连接缓冲液不合适重新配制连接缓冲液 三、DNA分子量标准问题分析： 问题原因解决办法带弱或无DNA带1) 上样DNA的量不够增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝胶减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4) 对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度DNA带缺失1) 小DNA带走出凝胶减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2) 分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3) DNA 变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4) 巨大DNA链，凝胶电泳不合适在脉冲电声凝胶电泳上分析DNA带模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量3) 所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4) DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐5) 有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白6) DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA不规则DNA带迁移1) 对于λ/Hind III片段COS位点复性电泳前加热DNA 65℃加热5-10分钟，然后在冰上冷却5分钟2) 电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力3) DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 以λ/Hind III为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题，解释原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDNA片段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。解决以上问题的办法，是在电泳之前，把DNA分子量标准67℃加热约10分钟，然后立即放入冰浴中骤冷，待样品冷却后上样。这样即可解离复性的粘性末端，使电泳过程DNA片段形成正常的带型分布。 |
