1.3定量方法

在real-timeQ-PCR中，模板定量有两种策略:相对定t和绝对定。相对定t指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的f的变化。绝对定t指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的to

1.3.1标准曲线法的相对定f由于在此方法中f的表达是相对于某个参照物的f而官的，因此相对定f的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的t来自于标准曲线，最终必须除以参照物的t，即参照物是1，的样本，其它的样本为参照物t的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在墓因表达研究中，内源控制物常为一些管家墓因(如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氮酶UAPDH等)。

1.3.2比较CT法的相对定量比较CT法与标准曲线法的相对定t的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对t，前提是假设每个循环增加一倍的产物数I，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的量，一个循环(CT=1)的不同相当于起始棋板数2倍的差异。但是此方法是以靶墓因和内源控制物的扩增效率墓本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。

1.3.3标准曲线法的绝对定量此方法与标准曲线法的相对定f的不同之处在于其标准品的量是预先已知的。质粒DNA和体外转入的RNA常作为绝对定f标准品的制备之用。标准品的f可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。

2实时荧光定量PCR技术的应用

Real-timeqPCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核普酸多态性(SNPs)的测定等。以下就目前real-timeQ-PCR在易位墓因的检测，细胞因子的表达分析，肿瘤耐药墓因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。

2.1微小残留病变的检测肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤

常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变(MRD)的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。Real-timeQ-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病(AML)最常见的染色体异常是交互易位t(8;21)(g22;q22)，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究[1o〕证明用real-timeqPCR来检测融合基因有助于对这些病人的MRD进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病(CML)的BCR-ABI_融合墓因〔”气急性琳巴细胞性白血病(ALL)的白血病特异的TEL-AML1融合基因〔iz],滤泡状琳巴瘤(Fl,)的染色体易位t(14;18)(g32;g21)[Is」和bel-2重排C14〕等。许多研究都在很大程度上受益于real-timeQ-PCR方法的应用，随着技术的发展，Real-timeQ-PCR的运用将不断地扩大。

2.2细胞因子的表达分析细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应(包括琳巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系统中起若核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子f的蛋白质，其中包括琳巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组:白介素(II.1-"IL-23)，干扰紊(IFN-+,IFN-Y等)，集落刺激因子(CSF),肿瘤坏死因子(TNF),肿瘤生长因子(TGF-月等)和化学因子(MCP-1,MIP-1等)[I]。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定t是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含t往往极低，然而real-time反转录PCR(RT-PCR)以其高敏感性和准确性在细胞因子的定f中越来越受到青睐。

2.3肿瘤耐药荟因裹达的研究对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞的耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有:ATP结合盒墓因超家族(ATP-bindingcassettesuperfamily)的膜转运蛋白介导的耐药[15]，这些蛋白包括:MDR-1墓因编码的P-枪蛋白(P-gp)，多药耐药相关蛋白(MRP)，肺耐药相关蛋白(LRP)，乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等，酶介导的耐药，包括拓扑异构酶(Topo)，谷胧甘肤(GSH)及谷胧甘肤-S-转移晦(GST),蛋白激酶C(PKC)，脱氧胞喻健核普激酶(deoxycytidinekinase)等;凋亡墓因介导的耐药[“〕，如bcl-2家族，p53墓因，c-myc等。多药耐药(MDR)是多因素，多种机制共同作用的结果。real-time反转录PCR(RT-PCR)是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药墓因mRNA表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。

2.4病毒感染的定f监测扩增技术的发展使得对病毒的定性或定t检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。Real-timeQ-PCR是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术，它不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使临床医生和病毒学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。目前运用较多的是在器官移植中对使用免疫抑制剂的病人用Real-timeQ-PCR来定量测定CMV感染。研究表明在骨髓移植的病人中用Real-timeQ-PCR检测CMV感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗CMV药物治疗能使血中的病毒含量下降，Real-timeQ-PCR对于快速定量骨移植病人的CMV感染和监测CMV复活是一个有用的工具。

3存在的问题及应用前景

在real-time令PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有侍解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用:eal-timeqPCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。另外，与传统的PCR技术相比，Real-timeQ-PCR的不足之处是[18]:(1)由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小;(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-timeQ-PCR的复合式multiplex)检测的应用能力;(3)目前real-timeQ-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展，目前real-timeQPCR已成为科研的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面real-timeQ-PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核普酸探针杂交技术的发展以及real-time技术的应用，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医生对疾病的诊断和治

疗。

4结语

Real-timeqPCR的发展使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的手段去研究许多重要的基础课题。虽然此技术仍存在一些不足需要改进，但是它为real-timeQ-PCR在常规诊断检测中的运用打下了良好的基础oReal-timeQ-PCR将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。