矛头腹蛇血凝酶的检查方法
纯度(1)照电泳法(通则0541第五法,非还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法)测定。取鉴别(4)项下供试品储备液30μl,加非还原型供试品缓冲液10μl,混匀,置沸水浴中加热5分钟,作为供试品溶液。取供试品溶液15l,加至上样孔,分离胶浓度为12.5%,用考马斯亮蓝R250染色,应显示一条带(2)照高效液相色谱法(通则0512)测定。供试品溶液取本品,加流动相A溶解并制成每1ml中约含蛋白质1mg的溶液色谱条件用丁基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺水溶液为流动相A,以0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺乙腈溶液为流动相B,按下表进行梯度洗脱;检测波长为280nm;进样体积50l。时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)测定法取供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图限度按峰面积归一化法计算,矛头腹蛇血凝酶主峰面积应不低于总峰面积的95.0%分子量照电泳法(通则0541第五法,还原型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法)测定。取鉴别(4)项下的供试品溶液与分子量对照品溶液(系列标准蛋白质分子量范围为10K~120K,照说明书使用),照鉴别(4)项下的方法测定。本品分子量应为36000±磷脂酶A照紫外-可见分光光度法(通则0401)测定。供试品溶液取本品,加水溶解并稀释制成每1ml中含单位的溶液对照溶液取磷脂酶A(蜂毒),加水制成每1ml中含3.6单位的溶液。测定法取37℃预热的卵磷脂溶液(取卵磷脂0.67g,加水适量,溶解成胶体溶液后,调节pH值至8.95,加水至100ml)2ml,置lcm吸收池中,加37℃水浴中预热的供试品溶液或对照溶液1ml,混匀,以水代替供试品溶液,同法操作,作为空白。在546nm的波长处分别测定吸光度为A1和As,再于37℃±0.5℃水浴中保温10分钟,分别测定吸光度为A和As2。限度供试品溶液吸光度增加值不得大于对照溶液吸光度增加值(即每1单位供试品中磷脂酶A含量不得大于0.36单位)。单位定义:在37℃、PH8.5条件下,每分钟使1.0mol的L-α磷脂酰胆碱(L-α-卵磷脂)水解成Lα溶血磷脂胆碱和个脂肪酸的酶量定义为1单位。L氨基酸氧化酶照紫外-可见分光光度法(通则0401)测定。供试品溶液取本品,加水溶解并稀释制成每1ml中含10单位的溶液。 对照溶液取L氨基酸氧化酶(东部菱背响尾蛇),加水制成每1ml中含0.056单位的溶液测定法取37℃预热的亮氨酸溶液[取亮氨酸0.1g,3,3-二甲氧基联苯胺6.5mg,加三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液(取三羟甲基氨基甲烷1.21g,置烧杯中,加水60ml溶解,用6mol/LHCl溶液调节pH值至7.6,转移至100ml量瓶中,用水稀释至刻度)溶解并稀释至100m]2.97ml,置1cm吸收池中,加37℃预热的过氧化物酶溶液(取过氧化物酶10mg,加水溶解至10ml,临用时配制)10l,分别加入供试品溶液或对照溶液20μl,混匀;以水代替供试品溶液,同法操作,作为空白。在436mm的波长处分别测定吸光度为A1和As,再于37℃±0.5℃水浴中保温5分钟,分别测定吸光度为A2和As2限度供试品溶液吸光度增加值不得大于对照溶液吸光度增加值(即每1单位供试品中L氨基酸氧化酶含量不得大于0.0056单位)。单位定义:在37℃、pH6.5条件下,每分钟使1.0mol的L氨基酸氧化脱氨基的酶量定义为1单位磷酸酶照紫外-可见分光光度法(通则0401)测定供试品溶液取本品,加水溶解并稀释制成每1ml中含10单位的溶液。对照溶液取磷酸酶(小麦胚),加水制成每1ml中含0.03单位的溶液测定法取0.165%对硝基苯磷酸二钠溶液(pH8.5)lml,分别加入供试品溶液或对照溶液0.1ml,置37℃±0.5℃水浴中保温30分钟,再加0.02mol/L氢氧化钠溶液10ml,摇匀;以水代替供试品溶液,同法操作,作为空白。在400mm的波长处分别测定吸光度。限度供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液吸光度(即每1单位供试品中磷酸酶含量不得大于0.003单位)。单位定义:在37℃、pH4.8条件下,每分钟水解1.0ymol的对硝基苯磷酸二钠的酶量定义为1单位神经毒取本品,加氯化钠注射液溶解并稀释制成每1ml中含2单位的溶液,作为供试品溶液。取体重为300~500g的鸽子3只,每1kg体重注射供试品溶液0.5ml,静脉给药,观察24小时。动物不得出现神经行为异常,如步态不稳,翻正反射消失,前后肢握力减弱,抽搐,颈项强直等,或死亡;如3只鸽子中有一只出现上述神经行为异常或死亡,应另取鸽子5只复试,均不得出现神经行为异常或死亡。出血毒取本品,加氯化钠注射液溶解并稀释制成每lml中含50单位的溶液,作为供试品溶液。取体重18~22g的小白鼠5只,每只一侧背部皮下注射0.2ml,另一侧注射氯化钠注射液0.2m作对照,注射24小时后处死动物,剥皮观察,与对照部位相比,小鼠背部均不得有出血现象。细菌内毒素取本品,依法测定(通则1143),每1单位矛头腹蛇血凝酶中含内毒素的量应小于50EU 异常毒性取本品,加氯化钠注射液溶解并稀释制成每1ml中含1.0单位的溶液,依法测定(通则1141),按静脉注射法给药,应符合规定
