1. 培养细胞,用病毒感染细胞(见基本方案 4 步骤 1~4)。
2. 加入 2 ml 的完全 MEM-5 培养基,按所选用启动子的类型决定培养时间:早期启动子为感染后的 1~6 h;晚期启动子为感染后的 4~20 h。
3. 吸出培养基,加入含有 25~50 mCi [35S] 蛋氨酸或 [35S] 半胱氨酸的 0.5 ml 完全不含蛋氨酸或半胱氨酸的 MEM-5 培养基和 35 μl 完全 MEM-5 培养基,培养 2~3 h 到过夜。
4. 追加 0.15 ml 的完全 MEM-5 培养基,继续培养 1 h。
5. 吸出培养基,如果是分泌型表达蛋白则保存培养基。
如果分析培养基,将其离心 3 min 以去掉残留的细胞。
6. 加入 1 ml 的 PBS,刮下细胞,将其转入微量离心管,室温最大转速离心 3 min,弃上清。
7. 用 200 μl 细胞裂解液重悬细胞,涡旋混匀并在冰上放置 10 min。
8. 40℃,最大转速离心 10 min。吸出上清,进行免疫沉淀。 展开 |