扫描免疫电镜技术
实验概要
本文介绍了扫描免疫电镜技术的具体操作步骤，扫描免疫电镜技术可为研究细胞或组织表面的三维结构与抗原组成的关系提供可能性。
实验原理
免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。
实验步骤
1. 标本处理
1) 细胞悬液：用10ml PBS内含1mg/ml牛血清白蛋白(PBS—BSa )悬浮细胞，离心250g，5min×2。加入PBS—BSA 至105-106细胞/ml，振摇成单细胞悬液。BSA能减低生物标本的非特异性吸附，但注意浓度应适宜，过高会减弱特异性反应。
2) 细胞附着于固体支持物：由于固定与免疫标记的孵育过程会引起细胞凝集，妨碍细胞表面的暴露，而且反复的离心与悬浮会导致细胞表面形态的改变。因此，通常将悬液中的细胞粘附于过滤膜或涂有带正电荷聚合物的盖玻片上，在粘附之前可依1)法清洗标本，以除去细胞表面的附着物。固体支持物可用涂有多聚—L—赖氨酸薄膜的载片或直径13nm、孔径0.22或0.45μm的过滤膜，载片制备方法：多聚—L—赖氨酸(Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于载片上，4℃30min后倾倒掉表面液体，令其自然干燥。注意载玻片事先需要清洁液浸泡，水漂洗过夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用绸巾拭干。将细胞悬液(如细胞数少可事先离心，取沉淀细胞)，滴于滤膜或载片上，由于多聚赖氨酸的粘附性，在固定及免疫标记过程中细胞不至于脱落。但注意勿使细胞干燥。
3) 组织切片与固体组织：组织切片如为石蜡包埋应预先脱蜡，由二甲苯经梯度酒精至水。组织切片与固体组织(勿过大)均应以PBS—BSA冲洗，并保持湿润避免干燥。
2. 固定
1) 固定前用PBS—BSA冲洗5min×3。
2) 选择加入适合的固定剂；可为4%多聚甲醛 0.1%-0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸缓冲液中。室温固定10-60min，或4℃30-120min。
3) PBS—BSA冲洗5min×3。
4) 除去残留的自由醛基，选以下任一方法：
0.5mg硼氢化钠/1ml PBS 10min(新鲜配制)
0.05-0.2mol/l 甘氨醊或赖氨酸—HCl/PBS 30-60min。
0.1-0.5mol/L氯化钠/PBs 30-60min。
PBS—BSA冲洗5min×3。
3. 免疫标记与透射免疫电镜的原则及步骤基本相同。
1) 血细胞以PBS—BSA冲洗5min×3。
2) 2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h
3) PBS或TBS反复冲洗5min×3。
4) 胶体金免疫标记程序(略)
5) 暗室显影液显影
6) 扫描电镜样品制样
7) 观察
4. 常规扫描电镜标本处理
1) PBS—BSA冲洗5min×3。
2) 后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液，时间视样本大小而定，一般室温30min左右。
3) PBS—BSA洗5min×3。
4) 1%四氧化锇后固定1-2h
5) 系列梯度乙醇或丙酮脱水
6) 临界点干燥或冰冻干燥
7) 喷镀碳与金
8) 扫描电镜观察
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