痘苗病毒系统基因表达实验
重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染
两种重组痘苗病毒共感染细胞
| 实验方法原理 | 本方案从构建外源基因位于 PT7 和 T7 终止子之间的质粒载体开始，然后用重组质粒通过脂质体介导转染已经被vTF7-3（可以持续表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的细胞。收获后，基因产物在细胞内的表达可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分析鉴定。 |
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| 实验材料 | 脂质体悬液 vTF7-3 痘苗病毒储液 生长至汇片的 CV-1 细胞 重组质粒 |
| 试剂、试剂盒 | 低血清 Opti-MEMI 培养基 完全 DMEM-10 培养基 |
| 仪器、耗材 | 6 孔组织培养板 杯状超声仪 聚苯乙烯管 |
| 实验步骤 |
1. 用 CsCl/溴化乙锭离心或 PEG 沉淀纯化重组质粒，每孔细胞需要 5 μg DNA 进行转染。 如果使用 pTM1 质粒（图 16.16.2）, 必须保证目的基因起始 ATG 位于 pTM1 的 NcoI 位点。可以通过限制酶作图或 DNA 测序鉴定构建是否正确。 2. 在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培养基将 5×105 CV-1 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养。直至细胞几乎汇片生长（一般过夜）。用血球计数器对细胞进行计数。 3. 将 vTF7-3 储液涡旋混匀以打散团状物。按照下面的步骤用杯状超声仪进行超声： 3.1 在杯中装入冰水（大约 50％ 的冰）； 3.2 将装有 vTF7-3 储液的小管放在冰水上； 3.3 以最大功率超声 30 s，储液置冰水上 >30 s，再继续超声。 4. 用 Opti-MEMI 将病毒稀释至 2×107 pfu/ml。 5. 用 0.5 ml/孔的稀释病毒储液（10 pfu/细胞）感染步骤 2 制备的 CV-1 细胞。温育 30 min，每 5～10 min 晃动一次。 6. 在感染结束前 5 min 制备脂质体悬液。加入 1 ml 的 Opti-MEMI 至 12 mm× 75 mm 聚苯乙烯管中（每孔制备一管），涡旋脂质体悬液，加 15 μl 至培养基中，涡旋混匀。加入 5 μg 的重组质粒（来自步骤 1），轻轻混合均匀。 脂质体在储存期间会沉淀，因此在使用前，应将其涡旋混匀。不要使用聚丙烯管，因为 DNA/脂质体混合物会吸附在其表面。 7. 吸出 CV-1 细胞的病毒接种物，直接加入 DNA/脂质体混合物。培养 5～24 h，表达的蛋白质可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法鉴定。
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| 注意事项 |
1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，除非有特殊说明。 2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。
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| 其他 |
重组质粒：将目的基因亚克隆到 pTF7-5 或 pTM1 载体或其他含有 T7 启动子的质粒。 |
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