胶体金及金标检测技术研究进展
继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）之后，一种固相标记免疫测定技术--免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique, ICG）逐渐发展起来。它是以胶体金作为标记物，利用抗原抗体特异性反应，对抗原或抗体物质进行定性乃至定量研究的标记技术。近年来，该技术因其操作简便、观察直观、灵敏度高、价格低廉等优点在医学、动植物检疫以及食品安全监督等各领域均得到了广泛的应用。
1.胶体金的制备
胶体金即金的水溶液，是指分散相粒子直径在1-100 nm的金溶胶。由氯化金溶液在还原剂作用下，金离子还原成金原子，从而凝合形成特定大小的金颗粒，因其中正负离子组成胶粒的双电子层结构，从而使溶胶处于稳定状态，故称胶体金。
1.1制备方法
胶体金制备大体可分为分散法和还原法两种，目前多采用还原法制备胶体金，主要包括：白磷还原法，抗坏血酸还原法，枸橼酸三钠还原法，乙醇—超声波还原法，硼氢化钠还原法和鞣酸-枸橼酸钠还原法等方法。白磷还原法制得的胶体金颗粒直径在3nm左右，颗粒大小均匀性好，但白磷易燃易爆，配置时需十分小心。枸橼酸三钠还原法在实践中最为常用，工艺过程简单，重复性好，而且可通过调整溶液中枸橼酸三钠浓度，来控制胶体金颗粒大小。乙醇—超声波还原法在实践中很少应用，一方面是由于工艺过程不好控制，重复性差，另一方面是所制金颗粒较小，除了免疫组化电镜技术中用小颗粒胶体金外，免疫检测技术中所用胶体金颗粒一般在50 nm左右。硼氢化钠还原法在实践中也很少应用，一方面是由于工艺过程不好控制，重复性差，另一方面是所制金颗粒较小，除了免疫组化电镜技术等研究试验使用外，金标免疫检测技术中很少使用。鞣酸-枸橼酸钠还原法为常用方法之一，可通过鞣酸的浓度来控制胶体金颗粒大小。但要注意：鞣酸溶液一定要避光保存，温度必须控制在60℃，否则会影响胶体金的均一性。
1.2影响胶体金制备的因素
除了严格的制备工艺技术外，玻璃器皿的洁净度和水的洁净度会直接影响胶体金制备效果，杂质污染会影响胶体金的均一性。玻璃容器用双蒸水洗过后需做硅化处理，所有溶液必须用经0.45μm微孔滤膜处理的双蒸水配置。
2 胶体金标记蛋白质
2.1 胶体金标记技术原理
胶体金的颗粒表面带有较多的负电荷，能迅速而稳定的吸附带正电荷的高分子物质（如抗体分子、植物凝集素和蛋白A）而不破坏其生物活性。因此，利用胶体金的物理学特性来标记一些生物活性物质作为免疫探针，用于免疫组化抗原定位及抗原、抗体检测。
2.2 胶体金标记蛋白质影响因素
胶体金与蛋白质之间是通过正负电荷之间存在的范徳瓦尔引力相结合的，胶体金颗粒与蛋白质分子之间无共价键联系。胶体金标记蛋白质过程属于物理过程，标记体系的pH值、离子浓度及二者的比例等均可影响标记效果，一般情况下，当胶体金pH值接近或大于蛋白质等电点时，胶体金对蛋白质的吸附力最强。反之，当胶体金pH值低于蛋白质等电点时，则会凝集而失去结合能力。如在标记葡萄球菌A蛋白（SPA）时，SPA等电点是pI5.1，胶体金的pH值可选择在pH5.9-6.2。标记单抗时，胶体金的pH值适宜在pH8.2。对于含有多种大分子蛋白的样品，如多价抗体的标记，实际上很难满足体系中各种蛋白分子的等电点的要求。为了取得较好的标记条件，可先将标记蛋白用低于pH9.0的缓冲液透析，胶体金的pH值调在pH9.0进行标记。
影响胶体金标记蛋白质是否成功的另一个重要因素是胶体金与标记蛋白质的用量比例。通常蛋白质的用量取决于胶体金的颗粒大小，金颗粒直径越小，金颗粒所具有的总表面积就越大，可吸附蛋白质的量也就越大。由于胶体金制备过程中误差会造成金颗粒的不均一性及不同蛋白质之间稳定点的差异，在胶体金蛋白质标记时，最好在每次实验前都进行蛋白质最小稳定点测定，以保证能获得最佳标记率。
2.3 胶体金标记蛋白质的分离纯化
各种方法所得到的胶体金颗粒直径，是大多数颗粒的平均直径。实际工作中所得到的胶体金，是各种近似直径颗粒的混合体，标记过程中，并不是所有金颗粒都可以得到稳定。因此，胶体金标记蛋白质后，必须进行分离纯化，以除去未参与标记的过量蛋白质、未稳定的金颗粒及各种可能形成的聚合物。在胶体金标记蛋白质过程中，除严格控制胶体金的制备工艺外，标记后选择合适的纯化方法十分关键。金标蛋白质的分离纯化与同位素、荧光素、发光剂及酶标抗体的纯化方法不同，其主要特点是金标蛋白质的质量大，并以溶胶形式存在，对纯化过程中的pH值、离子强度变化及某些杂质等因素较为敏感，不易采用盐析、离子交换、亲合层析等常规方法进行分离。目前主要采用超速离心和凝胶过滤两种纯化方法。
3.免疫胶体金快速诊断技术
提到胶体金快速诊断技术，不得不首先提到POCT。在临床医学检测技术中，POCT（point of care testing，简称 POCT）是指任何由医院专业人士或非专业人员，在检测中心以外进行的检测，简称为即时检验。它使烦琐的检验过程得以简化，取代了需要较高维护成本的传统仪器设备。近年来，随着微加工技术的发展和生物学领域的要求，发展易于操作、检测信号易于判断、试剂消耗量少、反应时间、自动化程度更高、仪器小型易携带、可实现高通量、大规模的检测的POCT快速诊断技术已成为国内外研究的热点。
目前，医学检验中应用的免疫胶体金快速检测技术主要有快速斑点免疫金渗滤法（DIGFA）和胶体金免疫层析法（GICA）两种方法。这两种方法都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金标记物与之反应形成红色可见结果从而达到检测目的。
3.1胶体金免疫渗滤技术
Vakirs等于1985年建立了金标免疫滲滤技术，该技术原理是：先用胶体金标记二抗，随后将抗原物质包被于醋酸纤维素或硝酸纤维束膜，最后采用特定形状的塑料卡盒及吸水滤纸等组装垂直渗滤装置。反应过程是；先将检测样品（血清）加在反应膜上，若样品中存在被检特异性抗体，则检测样品快速渗滤通过反应膜时，样品中的特异性抗体就会与包被于反应膜上的抗原结合，随后用缓冲液渗滤洗去样品中剩余的物质，再将金标二抗加于反应膜表面，当金标二抗在反应膜的渗滤过程中，金标二抗就会与结合于反应膜上的特异性抗体结合，最后用缓冲液渗滤洗去未结合的金标二抗。此时，反应膜上会显示出红色的点。若样品中没有被检特异性抗体，则抗原抗体连锁反应不成立，金标二抗不会留在反应膜，也就不会出现红色的点。由于金标免疫渗滤技术操作简单，反应速度快，2-3分钟出现结果，特异性强，敏感性高，此项技术自诞生之日期，备受业界高度关注。Spielberg等于1989年建立了人类免疫缺陷病毒抗体检测金标免疫渗滤检测技术。金标免疫渗滤技术现已应用于医学临床检验，疫病预防、动物疫病防控，食品安全检测及农业病虫害检测等领域。金标渗滤法的最大缺陷是金标抗体有效期短，一般为6个月。
3.2胶体金免疫层析技术
90年代初在金标渗滤技术的基础上建立起了一种简易快速的免疫学检测技术，即金标免疫层析技术。其技术原理是：将金标抗体固化在玻璃纤维或无纺布上，同时在硝酸纤维素膜上包被一条检测线及一条控制线，随后一同和样品垫、吸水垫及不干胶一起组合粘贴在塑料垫板上，再按一定规格切成检测条。检测时，样品首先吸附在样品垫，样品在水平流动过程中将固化金标抗体溶解，并随之通过硝酸纤维素膜向吸水滤纸端继续水平流动，吸水滤纸会帮助样品流动。若样品中存在被检测物质，测硝酸纤维素膜上包被的检测线和对照线会同时显色。否则，反应膜上只出现一条对照线。金标免疫层析技术快速、简便、稳定性好，有效期可长达2-3年。Beggs等最先于1990年将此技术用于绒毛膜促性腺激素（HCG）检测。随后由胶体金代替胶体硒用于乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测，目前已广泛应用于病毒、细菌、毒品及各种蛋白质的检测，是目前临床检验应用仅次于ELISA的一种重要的检测试剂，但是检测时间却比酶免缩短近5倍，这大大促进了该方法的普及应用。
