电泳技术(electrophoretic techniques)简介-5
三、琼脂糖凝胶电泳法
1.仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。
2.试剂
(1)醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。
(2)甲苯胺蓝溶液取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。
3.操作法
(1)制胶取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下规定配制。
(3)点样与电泳在电泳槽内加入醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm，电流强度1～2mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。
(4)染色与脱色取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂
(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3)取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解，加20%乙醇制成250ml。
(5)染色液取0.25%(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液7%醋酸溶液。
3.操作法
(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56%过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm,然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下的规定。
(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1～2滴及
0.04%溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。
(4)染色和脱色电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡 10～30分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。
(5)结果判断将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。相对迁移率供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率
(R'<[m]>)进行比较。其计算式如下： 进胶端到供试品或标准品区带的距离相对迁移率(R'<[m]>)＝──
进胶端到溴酚蓝区带的距离扫描将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分，由各组分的峰面积计算百分含量。
五、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R'<
[m]>)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
1.仪器装置除另有规定外，同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.试剂
(1)丙烯酰胺液溶称取丙烯酰胺22.2g与双丙烯酰胺0.6g，溶于100ml水中，贮于褐色瓶中低温保存。
(2)凝胶缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2HPO4·2H2O)8.82g 、磷酸氢二钠(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g与十二烷基硫酸钠 2.0g，加水至1000ml(若有沉淀析出,可加温至37℃溶解)。
(3)电泳缓冲液将凝胶缓冲液稀释1倍。
(4)染色液称取25mg考马斯亮蓝R<[250]>,溶于57%乙醇与9.2%醋酸混合液100ml中。
(5)脱色液取无水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀释至1000ml。
3.操作法除下列规定外，其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(1)制胶用丙烯酰胺溶液－凝胶缓冲液－水－1.6%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺(需冷却)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045)配制而成。
(2)标准蛋白溶液及供试品溶液的制备取标准蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠 0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制。
(3)电泳调节电流使每管为8mA。
4.相对迁移率和分子量计算将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移率：
蛋白移动的距离染色前的胶条长度相对迁移率(R'<[m]>)＝───×───
脱色后的胶条长度染料移动的前沿距离以R'<[m]>为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出供试品分子量
