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细胞培养基本方法

2021.5.27

一)准备和安装过滤器
清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。

(二)合成培养基的配制
1、根据细胞目录中的说明，按下表选择合适品牌及货号的培养基干粉，用适量超纯水充分溶解。

培养基	品牌	货号
培养基	品牌	货号
D-MEM/F-12	GIBCO	12400024
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose)	GIBCO	12800017
F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder	GIBCO	21700075
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder	GIBCO	12200036
Leibovitz's L-15 Medium powder	GIBCO	41300039
McCOY's 5A	SIGMA	M4892
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) with ribonucleosides and deoxyribonucleosides	GIBCO	11900024
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) without ribonucleosides and deoxyribonucleosides	GIBCO	12000022
Minimum Essential Medium (MEM) powder	GIBCO	41500034
NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S MODIFICATION (F12K)	SIGMA	N3520
RPMI Medium 1640	GIBCO	31800022
EGF	SIGMA	E9644
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256-25G
MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED	SIGMA	M5017

2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
3、调 pH至7.2左右。
4、加水至终体积。
5、在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。
6、瓶口封好，4℃冰箱贮存。

(三)小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。胎牛血清不必灭活。
1、将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
2、处理后的血清贮存于4℃。
3、小牛血清在使用前好进行筛选以掌握血清的质量。

(四)生长培养基的配制
除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
1、培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。
2、按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。

(五)冻存细胞的复苏
1、应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至37-37。5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化。
2、将解冻后的细胞液在常温条件下，1000rpm离心5分钟。
3、弃上清，用少量培养基将细胞悬起，将细胞悬液转移至事先加入5ml完全培养基的T-25培养瓶中。将细胞混匀后，置培养箱中培养。

(六)传代:
1、贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。
2、悬浮细胞:
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。

(七)冻存
将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。

(八)注意事项
1、玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;
2、无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;
3、培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存;
4、消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存;
5、培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月一次。
6、进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。

干细胞培养基本方法

MEF P0细胞培养Protocol

复苏：

将MEF P0细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml，吹打悬浮。
轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系转移至1个T75培养瓶中培养，加入培养液14 ml。
放入37℃培养箱内培养。
复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的MEF完全培养液，可以使细胞生长的更好。

传代：

待细胞长到90%-100%满时进行传代，一般3-4天，具体视细胞生长情况而定。
吸除废液。
用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
加2.5 ml MEF完全培养液终止消化。
多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
按照1:2-1:3的比例进行传代。
放入37℃培养箱内培养。

冻存：

按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

冻存液配方：
MEF完全培养液80%，FBS10%，DMSO 10%

si lie霉素c处理：

一般地，P0代MEF细胞传至P3代时，可以进行丝裂，霉素C（Sigma，M0503）处理。处理过后的MEF细胞不再增殖，可直接作为feeder使用。
传至P3代的MEF细胞长至80%以上时，吸出旧的MEF完全培养液，加入含丝裂，霉素C（终浓度10 mg/ml ）的新鲜MEF完全培养液（以T75培养瓶为例，加入培养液的体积为10ml ）。37℃培养箱温育处理3小时。
吸出培养液，用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂，霉素C。
消化细胞、细胞计数并冻存。一般地，一个T25培养瓶铺1´106细胞。

细胞

丁香通

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