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基于质谱的蛋白质组学,揭示不老分子的抗衰奥秘

2022.11.30

  ——清华大学蛋白质化学与组学平台主管邓海腾教授专访

  近年来, NAD+的前体NMN作为抗衰老保健品成为京东最畅销的商品,这是因为NAD+可能和每个人的健康寿命都有关系。这激励着更多科学家们开展研究,探索NAD+多靶标抗衰老的功效和机理。基于质谱的蛋白质组学研究方法也在NAD+的研究中发挥重要作用。近日,分析测试百科网采访了清华大学蛋白质化学与组学平台主管邓海腾教授,他研究NAD+ 20余年,并正在用蛋白质组学和质谱技术,揭示生命更多的奥秘。


蛋白质组学平台 完整workflow

  清华大学蛋白质化学与组学平台隶属于清华大学蛋白质研究技术中心,致力于发展和应用蛋白质组、代谢组学以及化学生物学的技术方法,向全校各实验室和研究中心提供质谱、蛋白质组学和代谢组学的分析服务。在基础科研方面,邓海腾关注于氧化还原生物学,研究其在生物过程中的功能和作用机制;在转化医学的应用层面,致力于发展衰老及其相关疾病的生物标志物,开发提高健康寿命的小分子植物提取物、纳米抗体和疫苗类新型分子。

    通过多年的探索,邓海腾课题组已发展出一套从基础到转化的工作流程,从功能蛋白质组学出发发现靶标,筛选针对靶标的抗体和抑制剂,进而对抗体进行表达、纯化和功能化修饰,然后研究这些分子在细胞和动物疾病模型中的功能和作用机制。课题组可以独立完成临床前的整套工作流程,已经明确了几个衰老相关的靶标,发展了抗衰老的黄酮类分子和纳米抗体、相关的抗衰老疫苗研究也在顺利进行中。” 邓海腾介绍说。

  清华大学蛋白质化学与组学平台属于凤凰工程的一部分。2012年,我国生命科学领域最大的单体项目“国家蛋白质科学基础设施—北京基地(以下简称为‘凤凰工程’)”开始建设,清华大学负责复合结构蛋白质组解析系统及功能蛋白质组研究系统的部分设施支撑。在凤凰工程清华基地设施建设基础上,成立“清华大学蛋白质研究技术中心”,下设11个子平台,其中便包括了早在2008年9月成立的蛋白质化学与组学平台。

  迄今,邓海腾教授带领的蛋白质组学平台与刘晓蕙研究员带领的代谢组学平台,可以为清华的各个院系和全球的研发机构提供涵盖所有蛋白质组学和代谢组学相关的服务。蛋白质化学与组学平台提供的常规服务如蛋白质鉴定、蛋白N/C端分析、蛋白质质量精准测定、蛋白-配体相互作用分析、定量蛋白质组学分析、抗体全序列测定、和组蛋白翻译后修饰谱分析等。

  “除了常规服务,我们还致力于发展功能蛋白质组学的服务能力,”邓海腾介绍说。比如,陈宇凌博士擅长开发微量蛋白定量方法;孟献斌工程师在交联质谱上有丰富的经验;田晓琳工程师发展和应用了氢氘交换质谱;李进工程师擅长蛋白复合物的分子量测定;韩萌工程师在Edman测序和蛋白质/抗体全序列测定上经验丰富。这拥有十八般武艺的团队为蛋白质组学平台带来了活力和效率,他们凭借专业的技术支持使平台能够为学校内研究提供高质量的服务,为更加深入地探究衰老的“本质”提供了有力的保障。

20年NAD+研究 探索抗衰机理

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NAD+的分子式

  NAD+(Nicotinamide adenine dinucleotide),全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,是维持人体生理功能的关键分子,从亚瑟.哈登1904年发现辅酶NAD+并获得Nobel奖以来,NAD+一直是生物医学研究的热点。

  NAD+是细胞中最重要的生物分子之一,它作为辅酶参与各类氧化还原反应,同时也参与了细胞能量代谢、信号传导和基因转录调控等过程。实验动物和临床研究表明,随着年龄的增长NAD+的水平大幅下降,而提高机体NAD+水平,能够改善甚至逆转多种衰老相关疾病的发生发展,提高健康寿命。近年来被追捧的NMN是NAD+的一种前体和高效补充剂。

  “去年,京东上卖得最好的一款营养品就是NMN。毫无疑问,NMN对健康寿命的提高有帮助,不然不会有那么多人用NMN。”邓海腾回顾说,“很多人会问我NAD+的相关问题,我们近20年一直开展NAD+的研究包括早期首次鉴定CD38和Sir2的反应中间体;目前关注于NAD+的各种前体,包括NMN的研究。”

  NAD+研究的难点是其既可以作为辅酶,同时也是DNA修复酶PARP、去乙酰化酶Sirtuins的底物。药物分子大都作用于一个靶标,而NMN补充则会影响细胞中多个生物过程,我们并不知道那一个生物过程对抗衰老贡献最大。不同的研究人员会应用不同的研究方法。“我们主要是应用蛋白质组学方法。”邓海腾说,“通过定量蛋白质组学,我们发现小鼠肾脏内过氧化物酶体的数量随着衰老而显著减少;小鼠服用NMN 1-2个月后,肾脏组织中的过氧化物酶体的数量大幅提高,增强肾脏的代谢水平,改善肾脏对损伤的反应。课题组还发现,在衰老的小鼠肝脏中,大部分高表达的酶都是抗氧化酶和解毒酶,调控这些酶表达的转录因子Nrf-2也高度分布在细胞核中,而衰老小鼠服用NMN以后,细胞核中的Nrf-2降低,提高了细胞的抗应激能力,保护了肝脏的生理功能,这可能是NMN最重要的生理功能。

  “我们对NAD+领域比较大的贡献是发现了一些作用机理。”邓海腾说,“我们揭示了NMN通过抑制炎症因子分泌,提高机体抵抗炎症的能力。”课题组相继在《细胞化学生物学》、《衰老》、《自由基生物学与医学》、《蛋白质组学研究》、《分子生物学前沿》和《细胞凋亡和疾病》等杂志上发表了一系列关于NAD+的研究论文,揭示了烟酰胺单核苷酸(NMN)及其衍生物的重要生物学功能和作用机制,并首次合成了还原型的NMN(NMNH),它在细胞水平和动物水平都具有更强地提高NAD+含量的功能,是一种高效的NAD+促进剂。邓海腾课题组通过多组学的大数据分析阐明了NMN新的生物学功能及作用机制,为衰老科学的发展提供了线索与研究思路。

  邓海腾总结说:“从上述角度来讲,NMN的功能无疑对健康非常重要;但也不是无所不能,所以我们研究的一个方向就是如何设计NMN的组方,提高人的健康寿命。”

赛默飞质谱:稳定易用、适应多种项目

  众多的研究成果离不开分析“利器”。 邓海腾谈到科学仪器和质谱的作用时说:“科学仪器是整个生物医学发展、尤其是上世纪以来生物医学发展最基础的工具。比如我们课题组任何重要的发现都离不开质谱。作为通用的工具,质谱既可以鉴定也可以进行量化和功能研究;若没有质谱,当今大部分生物医学的研究,尤其是蛋白质相关的研究会受到很多限制。对微观世界尤其在生物医学中微观世界的认识中,质谱是必不可少的工具。”

  “赛默飞质谱一直是我们实验室的主力仪器。”邓海腾回顾说,“我们近10年发表或参与发表的论文约230篇,每一篇都离不开赛默飞的质谱。可以这样讲,没有赛默飞的质谱,我们课题组的项目没有一个能够顺利进行下去。”

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邓海腾课题组的赛默飞质谱们

  “我本科学物理化学和电化学就用到质谱,后来在大学的研究平台工作,为研究课题组提供技术支持。”邓海腾说,“平台对仪器的要求是:稳定、容易使用、并能为研究机构中许多不同的研究项目提供支持。从早期使用LCQ和LTQ开始,对赛默飞质谱的印象就是:非常稳定、非常容易使用、并能够提供大量的Information。多年来,赛默飞质谱不断创新,解决了众多生物研究过程中的问题。选择Orbitrap,是因为众多的研究项目需要它。”

  “我经常带学生回顾Orbitrap发展的历史,这是仪器发展史上闪光的一页:从理论的一篇文章发展成商用质谱仪,2-3年发展出原型机,随后迅速迭代出多种不同的、具有革命性创新的质谱仪。50万的分辨率,为研究者提供了非常精确的蛋白质测量工具。近期推出的Orbitrap Ascend Tribrid,能够令研究者更深入地认识蛋白质变体、认识翻译后修饰,对蛋白质完整结构的认识达到更深入的层面。” 邓海腾还谈到了赛默飞的维修工程师:“他们很敬业,具有献身精神。赛默飞工程师深夜维修仪器的身影令我难忘。”

  谈到未来的合作期望邓海腾表示:“希望赛默飞的质谱能力不断扩展,我们可以同赛默飞一同合作,发展更多的技术和方法。首先是针对蛋白变体。蛋白质组学此前的策略大都用bottom up,实际上搜索的是基因库。未来,希望可以直接检测到蛋白质变体并解析蛋白的功能,这需要发展对蛋白变体的识别和定量技术。

  其次是研究细胞中蛋白的结构变化。此前氢氘交换技术可以看到in vitro(体外)蛋白的结构变化,但无法了解其在in vivo(体内)的变化,如果质谱可以提供这方面的信息,将极大帮助我们解析基因的功能。虽然目前分子热蛋白质组学技术可以发现一些小分子的靶标,但如何稳定、可重复地每一次都测到真正的靶标仍然具有挑战性,我们希望同赛默飞合作,发展更好的方法和技术来研究蛋白质组动态的结构变化。”

我国生物医学研究的水平和挑战

  谈到国内蛋白质组学等生物医学的研究时邓海腾表示:“近20年来中国实施了非常有效的政策方针,即施一公院长提出的:吸引一批优秀的人员回来,并为他们提供一流的技术平台。我的工作就是为一流的基础研究人员提供这种平台。20年来,从基础研究到技术研究,有大量的优秀人才从世界各地最好的实验室回到中国,并带来新的技术和理念;国家为他们提供一流的技术平台支撑。因为在微观世界的认识中技术是非常重要的一部分,好方向+好理念+技术支撑,使我国在生物医学领域已经占有领先地位。

  目前的差距主要还在技术领域,比如在仪器的研发上我国和国外实验室还有差距。比如美国西北大学利用Orbitrap开发的Charge detection技术,我国还没有此类工作的报道。此外,试剂的研发也存在差距,比如合成类似赛默飞的TMT试剂,将稳定同位素定点加到分子中是一个复杂的过程。”

未来展望

  “质谱还有很多的提升空间。”邓海腾展望质谱的发展时说,“首先是电离技术的改进。现在测定的分子大都具有较高的质子亲和性。希望将来可以利用质谱解析多糖结构,尤其是脂多糖的结构。解析脂多糖的结构和功能,还需要发展新型的电离方式。其次,质谱碎裂技术也有待改进。期待有更好的碎片技术,可以只产生简洁的b离子和y离子系列。第三,目前蛋白酶解产生的肽段,电离效率不一样。如果有一种技术可以让一个蛋白产生的肽段具有相同的电离效率,将是技术上的突破。第四,在色谱方面目前也缺乏能够精准分离蛋白的色谱,期待色谱柱或分离原理方面的突破。”

  “我的兴趣非常广泛”,邓海腾谈到未来的研究方向时说,“作为平台,我们为各种不同的研究项目提供服务和技术支撑,我们关注蛋白研究领域的变化和发展,比如当前热门的mRNA疫苗。将来能否直接用mRNA转化为蛋白来改善人的健康状况。我个人的兴趣是开发抗衰老疫苗,期望在3~5年后我们能推出一款疫苗,使得我们能够健康工作更长的时间。”

  人物简介

  邓海腾,平台主管 教授 博士生导师

  1996年在宾州州立大学获得博士学位,之后在加拿大阿拉伯塔大学和美国橡树岭国家实验室从事博士后研究,先后在爱因斯坦医学院和内布拉斯加大学担任助理教授,回国前任洛克菲勒大学研究副教授和蛋白质组学分析中心的主任。现担任清华大学生命科学学院教授和蛋白质化学及组学平台主管。主要研究领域为发展和应用蛋白质组学、代谢组学和化学生物学的技术和方法;研究氧化还原生物学在衰老和疾病中的功能和作用机制。

附录 邓海腾课题组NAD+的相关研究

对象研究结果意义文献
慢性炎症和肿瘤预防利用细胞模型和蛋白质组学分析发现衰老相关的NAD水解酶CD38的高表达降低了细胞内NAD的水平,引起胞内活性氧分子(ROS)的升高;而过高的ROS可以通过对15-PGDH第44位半胱氨酸残基的氧化磺酸化,导致15-PGDH发生不依赖泛素化-蛋白酶体通路的降解,从而提高了PGE2的水平,并驱动细胞发生上皮-间充质转化(EMT)。补充NAD前体如维生素B3和NMN可以通过降低ROS来抑制15-PGDH的降解和EMT过程。揭示了衰老过程中NAD+下降和肿瘤发生与发展之间的关系,并提示NAD前体可以预防肿瘤的发生和发展Cell Chemical Biology,2018, 25, 1–7
肝纤维化发现NMN通过保护15-PGDH免受氧化降解,抑制了肝星状细胞(HSC)的活化及促纤维蛋白的分泌,进而改善了肝纤维化症状。系统探究了NMN改善肝脏纤维化的功能并阐明了其作用机理,为NMN的应用提供了新的实验依据。Free Radical Biology and Medicine2021,162,571-581
炎症利用代谢组学方法发现在巨噬细胞活化过程中NAD+含量降低,而NMN的补充能够显著提高LPS刺激下巨噬细胞中的NAD+水平,降低白介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)的分泌量,抑制巨噬细胞的过度活化。基于定量蛋白质组学结果,发现COX-2介导了NMN抑制巨噬细胞活化的功能,提示NMN不仅可以通过稳定15-PGDH,也能通过下调巨噬细胞中的COX2的表达,抑制PGE2信号通路,揭示NMN如何抑制巨噬细胞活化Frontiers in Molecular Biosciences2021 Jul 6,8,702107
肾脏衰老应用串联质量标签的定量蛋白质组学,发现衰老小鼠肾脏中过氧化物酶体显著减少。过氧化物酶体参与了多个合成代谢和分解代谢过程,如胆汁酸的生物合成以及长链脂肪酸的氧化,而补充NMN能够大幅提高衰老小鼠肾脏中过氧化物酶体的数量,提示NMN能够促进过氧化物酶体的生物生成,恢复肾脏脂代谢的稳态,减缓衰老引起的肾功能衰退。 同时,该研究还鉴定到了27个潜在的肾脏衰老蛋白标志物。揭示NMN还可以调控亚细胞器的生物合成Aging (Albany NY), 2020 Nov 6,12(21),21890-21903
NMNH与NMN相比,NMNH在细胞水平和动物水平都具有更强地提高NAD+含量的功能,是一种高效的NAD+促进剂。还发现长期低剂量注射可以改变小鼠的多项生理功能,同时NMNH能够降低细胞的生长速度,阻滞细胞周期的进程。NMNAT是催化NMNH转化为NADH的关键蛋白。开创研究还原型NMN的先河,首次报道NMNH的化学和生物合成,并研究了NMNH独特的生物学功能。Journal of Proteome Research,2021 May 7,20(5),2596-2606
肝脏衰老定量蛋白质组学揭示衰老小鼠的肝脏中,大部分高表达的酶都是抗氧化酶和解毒酶,而且调控这些酶表达的转录因子Nrf-2也高度分布在细胞核中;衰老小鼠服用NMN以后,细胞核中的Nrf-2降低,提高了细胞的抗应激能力,保护了肝脏的生理功能。首次揭示NMN重要的生理功能之一是恢复衰老器官的蛋白稳态,增加机体的应急能力。Journal of Proteome Research. 2022 Jul 1;21(7):1759-1770.
NMN抑制细胞铁死亡CD38高表达是衰老的特征之一,我们发现CD38高表达促进二氢叶酸还原酶(DHFR)半胱氨酸磺酸化修饰并介导DHFR发生氧化降解,增加细胞对于铁死亡的敏感性,建立了CD38高表达与铁死亡之间的关系。NMN补充可以提高衰老小鼠中巨噬细胞对铁死亡的抵抗力。Cell Death Dis. 2022 Nov 9;13(11):944


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