AB Sciex视频讲座“QTRAP系统进行代谢物鉴定方法”
3月24日，AB Sciex 公司在分析测试百科网成功举办了题为“在药物发现和开发阶段代谢物鉴定的高级解决方案”的网络视频讲座。AB Sciex 的资深应用专家张克荣老师简单介绍了代谢物鉴定的应用和仪器概述，随后重点讲解用QTRAP®系统进行代谢物鉴定的方法。
代谢物鉴定的应用和仪器概述
代谢物的鉴定在发现和研发阶段一般采取LC-MS/MS的方法，2001年发布的代谢物测定的策略是：样品进入仪器后，采用串联四极杆的母离子扫描和中性丢失扫描进行代谢物发现，随后使用线性离子阱和三重四级杆做二级图谱，对发现的代谢物进行确证，可以完成80%的工作，使用线性离子阱的多级功能可以进一步确认代谢物，剩下的5%-10%的工作是用Q-Tof的精确质量数分析得到进一步的确证。这个分析过程需要多种质谱和多次进样。
到了今天，代谢物鉴定使用高精确质量数的仪器Q-TOF或者Orbitrap进行扫描，三重四级杆的母离子扫描和中性丢失扫描以及串联四极杆的MRM的模式发现代谢物，利用QTRAP®得到二级图谱进行代谢物鉴定。
QTRAP 5500 四极杆-线性阱复合型质谱仪
3200 Qtrap 四极杆-线性阱复合型质谱仪
4000 Qtrap四极杆-线性阱复合型质谱仪
QTRAP由3个四极杆组成，特殊性在Q3，Q3既可以作为四极杆使用也可以作为线性离子阱来使用，因此具有这两个仪器的特点。QTRAP的工作原理就是，Q0中第一次捕获、富集离子，Q1中选择母离子，Q2中碰碎，Q3捕获、富集后质量扫描。采用多重EPI（增强子离子扫描）可以检测共流出的代谢物。经过试验发现QTRAP的EPI全扫描的灵敏度比普通PI（子离子扫描）的灵敏度高出500倍，即使含量很低的物质也可以检测出来。
QTRAP除了具有串联四极杆和离子阱的所有功能外，信息关联采集的功能也可以保证切换快速完成，发现代谢物的同时也能够进行确证工作。经过比较可以看到pMRM的扫描模式在体内和体外代谢物检测时灵敏度、选择性都很优秀，代谢物的覆盖率也很好。
QTRAP®系统的扫描模式都包含在LightSight® v2.2软件中。使用该软件可以建立MRM、母离子丢失、中性离子丢失和EMS的扫描方法，软件和仪器连接，图谱可以自动添加，选择创建采集方法，能够自动得到分析结果。张老师举例向大家展示，LightSight 软件窗口一个工作区内，软件自动关联MS和MS/MS，对数据能够进行快速浏览，而且也方便对代谢物和母药MS/MS图谱的比较而进行代谢物结构鉴定。
QTRAP系统进行代谢物鉴定的方法
1、目标代谢物的鉴定方法
张老师以pMRM(预见的MRM检测)和IDA分析方法对大鼠静脉给药1mg/kg维拉帕米的代谢物检测为例来介绍QTRAP对目标代谢物的鉴定。
维拉帕米分子结构容易发生氧化和去甲基化，不同位置发生不同的反应后经过Q1、Q3会得到不同的质量峰。维拉帕米给药2小时以后大鼠的胆汁和尿样使用QTRAP进行测定，200多个离子对2.4s 就可以完成一个循环测定，在尿样中，pMRM检测维拉帕米代谢物得到色谱图后，可以自动给出二级图谱进行代谢物鉴定。使用pMRM-EPI方法，一次进样能够检测到23个维拉帕米的代谢物，使用3个EPI，多个共洗脱代谢物也可以被检测到，保证主要代谢物没有遗漏。
2、非目标代谢物的鉴定方法
张老师以使用MIM方法对奈法唑酮代谢物鉴定为例介绍了QTRAP进行非目标代谢物的鉴定方法。非目标代谢物检测时由于不知道代谢物类型，因而不能使用预测pMRM的方法，使用MIM方式或者Q3全扫描，MS判断同位素分布，使用IDA自动给出二级图谱。MIM是2008年Ming Yao博士提出的，就是在Q1时选择离子，Q2时只给一个很低的能量让其通过，Q3中进行检测。MIM的灵敏度优于全扫描，与MRM相当，适合低含量非目标代谢物的检测。
MIM扫描方式可以进行高通量代谢柔点分析，在数据后处理时可以采用EIC、PIF或者NLF方法进而发现待测的代谢物。以鼠肝中奈法唑酮代谢物检测为例，在二级质谱图中可以发现有一个中性丢失。MIM-EPI图谱就可以确定奈法唑酮的代谢物。使用QTRAP的MIM的方式可以发现奈法唑酮所形成的常见和不常见的代谢物。
3、多重母离子扫描/中性丢失结合正负极性切换
GSH即谷胱甘肽，它是一种三肽，容易结合在药物的反应点，在体内和体外药物结合时可能成为一种有毒性反应的标记，因此药物开发阶段低浓度的GSH的结合物的检测尤为重要。利用LC/MS/MS高灵敏度和高选择性来检测药物的活性代谢物与GSH结合物。
谷胱甘肽在ESI模式下容易发生中性丢失失去一个129的分子结构，而在负离子模式下失去一个272的碎片。使用QTRAP系统分析双氯芬酸活性代谢物鉴定中，经过正负模式转换，分析得到的图谱就可以进一步确定双氯芬酸的GSH结合物。
最后张老师总结了QTRAP在代谢物研究中的应用范围。AB Sciex 的QTRAP可以实现一机多用，独特的母离子/中性丢失/MRM-EPI功能，高通量，高易用性，使得QTRAP非常适合药物代谢的研究领域。
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问题与答案：
网友：pMRM预测得到的代谢物怎么验证呢?
张克荣老师：待测物的转换类型在进行预测MRM的同时，还进行EPI扫描方式，得到二级全扫描来进一步确证预测的代谢物。
网友：为什么在分析双氯酚酸时，使用ER功能呢?
张克荣老师：双氯芬酸与GSH结合物检测时有一个正负离子切换扫描的过程，通过ER去确定扫描某一时间点的质量数来进行下一步二级全扫描。
网友：QTRAP的离子阱功能和真正的离子阱功能有什么差别?
张克荣老师：离子阱的工作原理决定了分析中低质量碎片看不到，并且碎裂效率低，QTRAP在四极杆中碰碎母离子，碰撞效率高，而且不存在离子阱的1/3效应。
网友：四级杆实现离子阱功能是怎么实现的?
张克荣老师：在Q3两端加上2个电压，在四极杆上加上一个轴向电压，当离子进入以后，不进行扫描，而在Q3中进行捕获，由此做出的改进。
网友：pMRM-EPI的方式其他类型的仪器可以实现吗?QTRAP的优势在哪儿?
张克荣老师：pMRM-EPI的方式只有QTRAP类型仪器可以做。QTRAP的优势在于做MS/MS全扫描时，灵敏度比三重四极杆高两个数量级以上。
网友：研究天然中药提取物如皂苷类化合物代谢物时，可能质谱打到MS3时尚无法确定母核其他基团的取代位点，有什么解决办法呢
张克荣老师：QTRAP类型仪器在做MS/MS扫描时，可通过调节Q2中的碰撞能量获得丰富的碎片，然后对其主要碎片进一步做MS3来归属碎片是从母体药物直接碎裂还是从某一碎片碎裂，从而对离子碎片进行归属，来确定化合物结构。
网友：pMRM预测得到的代谢物怎么验证呢?
张克荣老师：根据同时得到的MS/MS图谱来进一步验证。
网友：为什么在分析双氯酚酸时，使用ER功能呢?
张克荣老师：实例中提到的是研究双氯酚酸的谷胱甘肽代谢物，研究谷胱甘肽代谢物时，试验方法为 (+)NL 129/ (-)PI 272 –(+)ER-IDA-(+)EPI试验方法，因为EPI为正离子模式，母离子扫描(PI)是在负离子模式下，通过ER扫描，可计算出负离子模式下找到的离子在正离子模式下的质量数，从而进一步在正离子模式下进行EPI。
网友：请问张老师，PIF和NLF是如何实现的?谢谢
张克荣老师：是通过AB SCIEX仪器控制软件Analyst中Script项下的IDATraceExtractor实现的。
网友：QTRAP的离子阱功能和真正的离子阱功能有什么差别，四级杆实现离子阱功能是怎么实现的，谢谢!
张克荣老师：QTRAP的离子阱做MS/MS时碎裂在Q2碰撞室中，与真正的离子阱相比，没有1/3效应，碰撞效率高。
网友：MIM与SIM的异同点，MIM如何实现，谢谢您!
张克荣老师：MIM是类同于MRM，经过Q1和Q3两个质量分析器选择分析。SIM是单通过Q1质量分析器选择或Q3选择进行检测分析。
网友：请问老师，pMRM与MIM相比，哪个更有优势?
张克荣老师：各有优缺点，应用方向不一样，pMRM主要用于做目标代谢物研究，MIM是侧重与非目标代谢物研究。
网友：如果没有sightlight软件，可以使用pMRM功能吗?
张克荣老师：可以。AB SCIEX的仪器控制软件Analyst软件也有此功能。
网友：请教张老师，获取双氯酚酸的数据时，可不可以使用同位素激发-EPI?
张克荣老师：可以在IDA Isotope pattern中设定同位素分布，满足此同位素分布的可优先选择触发EPI。
网友：能从电路等设计上说明一下吗，你没有解释四级杆怎么实现的离子阱，如果仅仅是捕获实现离子阱功能，它的效率应该步入正真离子阱
张克荣老师：Q3的出口加了透镜隔板，在Q3上加了两个Collar Lens，Q3的两个杆上加auxiliary RF。
网友：MIM的自动计算小软件是怎么回事呢?
张克荣老师：是通过EXCEL自动建立MIM离子对。
网友：如果是三重四级杆，没有QTRAP，可以做pMRM吗
张克荣老师：可以做pMRM，但不能同时得到MS/MS图谱。由于三重四极杆的MS/MS灵敏度低。
网友：刚才说的MIM功能，第一个Q选择离子，第二个Q通过，第三个Q再检测选择的例子，但是我记的讲座中的MIM是预测未知代谢物，或未知化合物的，如果是未知，怎么知道选择离子的质量数
张克荣老师：MIM是研究非目标代谢物研究，是设定包含一个质量范围内的所有离子来进行研究，Q1和Q3质量数是相同的。
网友：pMRM模式要在QTRAP上作吗，普通3Q怎么做
张克荣老师：pMRM-EPI是尽在QTRAP能实现。普通3Q只能做pMRM，AB SCIEX的Analyst软件中有此功能。
网友：刚才网友提到可以同位素激发，请问如何实现同位素激发?
张克荣老师：可以在IDA Isotope pattern中设定同位素分布，满足此同位素分布的可优先选择触发EPI。
网友：MIM时我们如何选 择Q1，不是不知道目标化合物吗
张克荣老师：是设定包含一个质量范围内的所有离子来进行研究
网友：刚才您说，MIM比pMRM好，是指它获得的谱图更好、灵敏度更好么?pMRM是不是速度更快些?
张克荣老师：不能说MIM比pMRM好或不好，两者各有优缺点，应用方向不一样，pMRM主要用于做目标代谢物研究，MIM是侧重与非目标代谢物研究。
网友：MIM的方式，是不是灵敏度较差,所以适合体外研究?那么PMRM/MIM-EPI，会不会影响扫描效率?因为MIM扫描的离子对很多。
张克荣老师：MIM灵敏度高于全扫描，可用于体内、体外研究。pMRM/MIM-EPI不会影响扫描效率，利用两者结合可代谢物的覆盖更全面。
网友：QTOF能做MIM吗?
张克荣老师：不能
网友：如果没有MIM的自动计算小软件，我们该怎么做MIM呢?
张克荣老师：只能自己手动输入了。
网友：是MIM比SIR好吗?
张克荣老师：两者不是一个概念。和离子阱的扫描模式EPI一起用，MIM-EPI要好于SIM.
网友：容量达到10的五次方，四级杆的质谱，是要加端盖电压的，离子不可能在一定的轨道上，所以离子容量不可能比离子阱高，能有深度的解释一下吗，讲座中
张克荣老师：这个问题能说的更明白些吗?我不是很理解。谢谢!
网友：课件可以发给我们一下吗?
张克荣老师：课件可到http://www.absciex.com.cn/webinar.asp网站下载。谢谢!或登录分析测试百科网下载讲座视频。
更多问题网友可以通过邮箱和张克荣老师联系，张老师邮箱：kerong.zhang@absciex.com
本次讲座的PPT录音文件参见网址：http://www.antpedia.com/corp/data-986.html
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