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李汉杰博士等开发新型测序技术及揭示肿瘤T细胞的转录

2018.12.28

  肿瘤组织中免疫细胞的组成在免疫治疗中起关键作用,然而人类肿瘤组织中免疫细胞的异质性和分化途径还有待研究。李汉杰博士等通过对25名黑色素瘤患者肿瘤中免疫细胞的单细胞转录组测序和单细胞TCR测序分析,发现大量的CD8 T细胞的转录组呈连续性梯度分布,跨越了从“过渡态”到“功能失调状态”的分化途径。相反地,细胞毒性CD8 T细胞是相对罕见的,并且不与过渡态T细胞或功能失调T细胞共有TCR,表明它们独立于过渡态和功能失调的细胞状态。出人意料的是,他们发现并证明功能失调的T细胞其实是肿瘤内增殖最快的免疫细胞并且功能失调的强度与肿瘤反应性有关。他们的数据表明,先前被认为是“耗竭”的CD8 T细胞实际上在肿瘤微环境中是高度增殖,且动态分化的。

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背景

  旨在重新激活肿瘤特异性T细胞反应的T细胞检查点阻断疗法革命性地改变了癌症治疗。然而,许多患者并没有获得长期的临床效果,可见我们对这些疗法的反应或抵抗机制的理解仍然不完整。最近的研究表明,癌症中免疫细胞的异质性对免疫治疗的效果有重要影响。

  T细胞是肿瘤免疫微环境中的重要组成部分。肿瘤内T细胞除了效应T细胞,记忆,调节性T细胞,还有“功能失调”或“耗竭”状态的CD8 T细胞群。这种功能失调的T细胞的特征包括丧失经典的CD8T细胞效应功能,如细胞毒性等【1, 2】。此外,人肿瘤中功能失调的T细胞分泌独特的细胞因子【2】。以前的研究认为T细胞衰竭伴随增殖能力的丧失,但最近的研究暗示人类肿瘤中高表达PD-1的T细胞具有增殖潜能【3, 4】。除了高水平的PD-1,功能失调的T细胞还高表达其它抑制性检查点分子如TIM-3和LAG3。目前,围绕以表达有抑制性检查点分子的T细胞作为免疫治疗效果的预测指标,还存有很多争论。在老鼠模型中,高表达抑制性检查点分子的T细胞似乎难以通过PD-1阻断被重新激活【5, 6】。然而,最近研究表明表达高水平PD-1的功能失调的T细胞的丰度与肺癌患者对PD-1抗体治疗的临床效果相关【4】。

  近日,以色列Weizmann Institute of Science的单细胞测序领域大牛Ido Amit实验室(李汉杰博士为论文第一作者)和Amos Tanay实验室,联合Netherlands Cancer Institute的肿瘤免疫学界大牛Ton Schumacher在Cell上发表了题为Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma的研究论文,对25个黑素瘤患者的肿瘤内免疫细胞进行了单细胞转录组和单细胞TCR分析。他们的研究发现尽管不同免疫细胞亚型存在于大多数患者中,它们的相对丰度在不同患者中存在很大差异。值得注意的是,尽管丰度不同,所观察到的CD8T细胞的的分化途径确是高度保守的。

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  特别地,他们发现两个相对独立的CD8T细胞群,其中一群经由一个“过渡态”分化为功能失调的T细胞。这些功能失调的T细胞表达已知的(PD-1,LAG3)和新的(例如,ETV1,AKAP5,CSF-1, ZBED2)调节分子。通过整合单细胞T细胞受体(TCR)测序和转录组分析,他们发现在功能失调的T细胞群中,有很多T细胞的TCR序列是相同的,表明功能失调的T细胞存在大量的克隆扩增。此外,通过对细胞周期相关基因表达的分析和细胞周期的流式细胞术分析,进一步证明了这群功能失调的T细胞处于高度增殖的状态。这种增殖能力主要存在于早期的功能失调T细胞,而更晚期的功能失调T细胞则失去了这种增殖特征。相反地,基于不同T细胞之间共有TCR的程度和基因模块分析,细胞毒性CD8T细胞在TCR及转录组特征上均与功能失调的T细胞类群没有联系。总的来说,他们的数据表明功能失调的CD8 T细胞在肿瘤微环境中处于动态分化和高度活跃的状态,而且很可能驱动着肿瘤特异性免疫应答。

结果

  人黑素瘤中免疫细胞的转录组异质性

  为了更好地了解黑色素瘤中免疫细胞的异质性,李汉杰博士等收集了来自25名黑色素瘤患者的总共46,612个肿瘤浸润免疫细胞的数据,基于Ido Amit实验室先前开发的单细胞测序技术【7】开发了能够同时获得单细胞转录组和单细胞TCR序列的新型单细胞测序技术。接着,他们开发并应用一种新的单细胞转录组分析方法, “MetaCell” 算法【8】。从单细胞转录组数据中鉴定出稳定且均质的细胞群(“metacells”),从而得到324个metacells的详细转录组,这些metacells组成七个大群,包括T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和浆细胞。

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  T细胞在肿瘤内的转录组呈连续,梯度分布

  分析显示肿瘤中T细胞包含初始T细胞,以及具有不同分化程度的CD4和CD8T细胞。初始T细胞含有的mRNA量很少,主要表达IL7R,CCR7,转录因子TCF7,和一些管家基因。相反地,非初始T细胞类群中的metacells显示出较高程度的转录组异质性。大部分(145 个metacells)的CD8T细胞可被细分为“过渡性” CD8T细胞(GZMK +),细胞毒性CD8T细胞(GZMH +)和大量功能失调的CD8 T细胞。功能失调CD8T细胞高表达免疫检查点分子,如PD-1和LAG3。分析显示在转录组的空间里这些不同CD8细胞类群之间的边界是弥散的,表明转录组的梯度表达是导致T细胞异质性的原因之一。 CD4 T细胞亚群主要含有表达FOXP3的调节性T细胞(Treg),同时也包括滤泡辅助T细胞(由CXCL13标记),以及一群类似功能失调CD8 T细胞的CD4 T细胞亚群。

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  CD8T细胞群内的免疫检查点分子表达水平呈连续的梯度分布

  通过对所有CD8T细胞 metacells里的细胞进行基因表达分析,他们鉴定了一些共表达的基因模块。这些基因模块包括与细胞毒性效应功能相关(GZMH,GNLY,FGFBP2和CX3CR1),或者与功能失调状态相关(TIGIT,PD-1,LAG3和CXCL13)。有趣的是,细胞毒性和功能失调的两个基因模块之前是呈负相关的。基于这些数据,他们计算了两个数值,一个量化功能失调基因模块的活性(基因模块锚定于LAG3),另一个评估细胞毒性基因模块表达的总体强度(基因模块锚定于FGFBP2)。然后,他们对所有CD8 metacells的“细胞毒性”数值和“功能失调“数值的分布进行比较,观察到”过渡性“CD8T细胞与功能失调的T细胞是连续分布的。相反的,细胞毒性T细胞和“过渡态” CD8T细胞之间或其与功能失调T细胞之间的连续性很弱。

  患者间功能失调的CD8 T细胞的丰度差异

  紧接着,他们系统地分析了每位患者的免疫细胞组成。总体而言,大多数观察到的T细胞类群在多数患者中都存在。这表明T细胞的转录状态在不同患者之间有一定的保守性,但不同患者中不同免疫细胞类群的丰度是有较大差异的。特别地,CD8功能失调T在肿瘤浸润性T细胞中的比例最低为3.6%,最高可达72.1%。

  功能失调的CD8T细胞具有增殖能力且形成大的克隆

  接着,李汉杰博士等整合了单细胞转录组和单细胞TCR序列分析。正如预期的那样,TCR克隆组成在患者中差异很大。一些患者中TCR很多样只有很小程度的克隆扩增,相反的一些患者TCR库主要由少数大的克隆构成。有趣的是,较大的克隆显示出功能状态的不均匀分布,大的T细胞克隆主要由功能失调的T细胞组成。同时,患者中功能失调的T细胞比例与T细胞克隆性(clonality)呈正相关。为了进一步研究观察到的克隆扩增是否可能是由于肿瘤内的T细胞增殖导致,我们通过细胞周期基因的表达水平来计算每个细胞的增殖分数,从而进一步计算不同细胞类群中增殖的细胞的比例。具体地,在功能失调的T细胞中观察到最高比例的增殖细胞,其比初始T细胞增殖的比例高了近10倍。 Ki-67的流式细胞术分析验证了功能失调的T细胞的增殖能力。在功能失调的CD8T细胞库中,在获得功能失调状态程序的早期阶段,增殖最为显著。高度功能失调的T细胞的增殖能力的降低可能归因于分化过程中增殖能力的丢失,或者由于高表达的抑制性受体抑制了细胞增殖。总之,克隆大小的增殖动力学和分布都支持黑色素瘤中功能失调的T细胞处于高度增殖和动态分化的状态。

  过渡性和功能失调的T细胞共有相同的TCR

  通过不同细胞类群之间TCR共有的程度,可以推断肿瘤中T细胞的谱系结构。TCR相同的T细胞一般属于同一类群。如预期的,CD8或CD4T细胞之间不共有TCR。为了系统地分析不同T细胞类群之间TCR的共有情况,他们计算了不同类群间TCR共有的程度,并与随机模型相比较,计算出一个TCR共有的富集值。正如所料,该数据显示CD4细胞和CD8细胞之间分离得非常清楚。更有趣的是,观察到过渡性CD8和功能失调细胞的有高水平的TCR共有,而与细胞毒性T细胞则没有。

  通过对来自3名黑色素瘤患者的外周血免疫细胞进行了单细胞测序分析,他们发现病人外周血中完全缺乏功能失调的T细胞,但存在大量初始,过渡性和细胞毒性CD8 T细胞。这说明功能失调的T细胞是在肿瘤内部进行持续的分化和增殖的,它们的分化与细胞毒性T细胞的分化在时空上是独立的。

  功能失调相关基因的表达水平和功能失调T细胞的丰度与肿瘤识别相关

  最后,为了进一步研究不同T细胞类群的肿瘤特异性,作者对10名患者的T细胞进行体外扩增,并测试扩增后T细胞对患者自体来源的肿瘤细胞的反应(下图)。

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  通过IFNγ和TNFα的表达来表征T细胞中是否存在肿瘤特异性的T细胞。在十个患者中有六个患者的T细胞能够识别肿瘤。通过CD8T细胞内功能失调基因表达水平对患者进行排序时,他们观察到对自体肿瘤细胞具有反应性的T细胞通常显示出更显著的CD8功能失调状态。这相关性暗示,功能失调的T细胞是肿瘤特异性的,而细胞毒性T细胞不是。最近有研究表明,CD39和CD103高表达和KLRG1低表达是肿瘤特异性T细胞的特征,而在与肿瘤无关的旁观者细胞中则低表达CD103,CD39,而高表达KLRG1. 与之相对应的,与细胞毒性T细胞类群相比,功能失调的T细胞类群的确显示CD39和CD103的表达增加,及KLRG1的低表达。综上,肿瘤特异性T细胞在肿瘤内部处于动态分化状态,经过一个“过渡状态”分化为功能失调状态。

参考文献

  1. K. E. Pauken, E. J. Wherry, Overcoming T cell exhaustion in infection and cancer. Trends Immunol. 36, 265–276 (2015).

  2. D. S. Thommen, T. N. Schumacher, T Cell Dysfunction in Cancer. Cancer Cell. 33, 547–562 (2018).

  3. X. Guo et al., Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing. Nat. Med., 1 (2018).

  4. D. S. Thommen et al., A transcriptionally and functionally distinct PD-1+ CD8+ T cell pool with predictive potential in non-small-cell lung cancer treated with PD-1 blockade. Nat. Med. 24, 994–1004 (2018).

  5. S. D. Blackburn, H. Shin, G. J. Freeman, E. J. Wherry, Selective expansion of a subset of exhausted CD8 T cells by alphaPD-L1 blockade. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15016–21 (2008).

  6. S. J. Im et al., Defining CD8+ T cells that provide the proliferative burst after PD-1 therapy. Nature. 537, 417–421 (2016).

  7. D. A. Jaitin et al., Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, 776–9 (2014).

  8. Y. Baran et al., MetaCell: analysis of single cell RNA-seq data using k-NN graph partitions. bioRxiv, 437665 (2018).

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