① 将1X107〜5X107个细胞加到1ml含有100mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。
②由于DNA的释放,在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏,克服黏性问题有2种方法:
a.离心裂解液100000g,20min,除去DNA;
b.超声破碎裂解细胞,每次超声15〜30s,共4次,每次之间将样品在冰上放置15s。
③在95℃水浴加热样品5min。
④20000g离心5min.
⑤转移上清到一个新管中。
⑥样品(上清)现在可以用于电泳和免疫印迹。在免疫印迹研究中,制备培养细胞提取物时,蛋白样品必须满足以下条件:
a.溶于适合凝胶电泳系统的溶液中(如,溶液的pH值应该在7.0左右,并且盐浓度为200 mmol/L左右);
b.蛋白浓度不能超过特定凝胶系统的承载能力。对于传统凝胶,小胶的每个泳道的上样量不能>150μg的总蛋白 展开 |