实验概要

采用浸入法将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜是先将凝胶紧贴于一块硝酸纤维素膜，然后再将这种夹层组合浸入盛有大量缓冲液的转印槽内，使电流从转印槽的一侧通向另一侧。通过电洗脱的方法可将蛋白质从凝胶中转印至滤膜上，如同在凝胶中迁移，只不过移动方向与胶平面垂直。若操作仔细，这是一种可将许多蛋白质转印至膜上非常有效的方法。此法比半干法稍微费时，也需用较多的缓冲液，但它更为简便。

但对浸入式转印，尚无一组条件能将各种蛋白质完全、均匀地转印并较好保持于膜上。根据待转印蛋白质的分子质量，可选用2种缓冲液中的1种，并根据经验确定不同的转印时间。以下列举的时间可作为参考。

主要试剂

硝酸纤维素滤膜

吸水滤纸(Whatman 3MM或替代物)

蒸馏水

转印缓冲液1(蛋白质为20 000-400 000kDa：0.1％(w／v)SDS、20％甲醇溶于50mmol／LTris碱和380mmol／L甘氨酸[无pH值])

或转印缓冲液2(蛋白质<80 000kDa)：20％甲醇、25mmol／LTris碱和190mmol／L甘氨酸(无pH值)

考马斯亮蓝染色液

主要设备

浸入式转印装置

实验步骤

1. 将凝胶切成所需大小用于转印。除去无关凝胶和未使用的凝胶泳道。将凝胶做好标记以确定第一条泳道的去向(一般是剪去凝胶底部左手边角即可)。在准备滤纸时，将疑胶放入转印缓冲液中。

2. 剪取1张硝酸纤维素膜和4张吸水纸(Whtaman 3 MM或替代物)，使其大小与凝胶相同。操作时戴手套并使用新的硝酸纤维素膜。蛋白质与硝酸纤维素膜的结合键型尚不清楚，但油污或其他蛋白质可阻碍此种结合。

3. 将硝酸纤维素膜浸入蒸馏水中。通常是小心地将硝酸纤维素膜放在水面上使其浸湿。通过毛细管作用从底部开始浸湿硝酸纤维素膜(数分钟)，然后将膜浸入水中2min。再放入转印缓冲液中5min。将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿。

   1) 转印缓冲液1(蛋白质为20 000-400 000kDa)的配制(1000ml浓度)

   Tris碱 48mmol／L 5.8g

   甘氨酸 390mmol／L 29.3g

   SDS 0．1％(v／v) 1.0g

   甲醇 20％ 200ml

   蒸馏水加至1000ml

   2) 转印缓冲液2(蛋白质<80 000kDa)的配制(1000ml浓度)

   Tris碱 25mmol／L 3．0g

   甘氨酸 190mmol／L 14．5g

   甲醇 20％ 200ml

   蒸馏水加至1000ml

4. 将凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸和支持垫浸入缓冲液中并保证其完全浸泡。小心地将支持垫中的气泡赶出。

5. 将转印夹层组合按图进行安装。使所有的部分保持湿润，务必使凝胶和滤纸之间接触良好。

6. 将转印夹层组合放入转印槽中，硝酸纤维素膜紧靠正极(阳极，红色电极)。

7. 转印4～18h。较厚的凝胶和分子质量较大的蛋白质需要较长的转印时间。可对下述条件进行优化使分子质量范围很广泛的蛋白质都得到转印。

对于375pxXl125pxX2.5px大小的凝胶，分子质量超过100 000kDa的蛋白质，可先用28V转印1h，然后于84V转印14～16h。若蛋白质的分子质量低于100 000kDa，则以63V转印4-16h即可。

在转印过程中，温度会明显升高。因此，需要使用冷却管或在低温室内进行转印以避免在夹层组合中产生气泡。

8. 转印结束后立即断开电源。小心拆开装置。在膜上做好标记(一般剪去底部左手边角，并定为第一泳道)。

9. 用考马斯亮蓝对凝胶进行染色或银染以验证转印物。硝酸纤维素膜经过适当处理后进行染色或封闭。

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