M13噬菌体载体的克隆
实验方法原理 虽然理论上 M13 重组噬菌体所能携带的外源 DNA 片段没有限制，但实际上是有限的：长片段的外源 DNA 比短片段的更易发生缺失和重排。因此如果可能，最好克隆至 M13 噬菌体的 DNA 片段不要大于 1000 碱基。而且，当用“正向”或“反向”通用测序引物进行 DNA 测序时，大片段的中心区域可能位于所能测到的区域外。
实验材料 噬菌体 T4 DNA 连接酶限制性内切核酸酶外源 DNA 测试 DNAM13 噬菌体载体DNA带有 F' 质粒的适当大肠杆菌菌株的感受态细胞大肠杆菌 F' 铺板菌体
试剂、试剂盒 ATP乙醇IPTG酚氯仿乙酸钠TEX-gal
仪器、耗材 琼脂糖凝胶YT 或 LB 琼脂平板YT 或 LB 培养基YT 或 LB 上层琼脂或琼脂糖培养管加热器冰浴水浴
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP (10 mmol/L)
乙醇
IPTG ( 20%, m/V)
酚: 氯仿（1:1, V/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
X-gal (2%, m/V)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.8%) 悬于 1 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 核酸和寡核苷酸
外源 DNA
测试 DNA
5. 培养基
YT 或 LB 琼脂平板
YT 或 LB 培养基
YT 或 LB 上层琼脂或琼脂糖
6. 专用设备
培养管（5 ml 或 15 ml, 如 Falcon 2054 或 2006, Becton Dickinson), 预冷至 0℃
加热器，调至 47℃
冰浴
水浴，调至 12~16℃ 和 42℃
7. 载体和菌株
M13 噬菌体载体 DNA (RF)
带有 F' 质粒的适当大肠杆菌菌株的感受态细胞
大肠杆菌 F' 铺板菌体
二、方法
载体 DNA 的制备
1. 用 3~5 倍过量的适当限制酶完全消化 1~2 μg M13 噬菌体 RF DNA，设立一个含 M13 RF DNA 而无限制酶的对照。
2. 温育将结束时，每个反应管取少量 DNA 样品（50 ng), 用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析消化程度。如果消化不完全（如还有可见的闭合环状 DNA), 加入更多的限制酶并继续温育。
M13 RF DNA 制品可能含有一定量的单链 M13 DNA, 这些 DNA 在琼脂糖凝胶电泳时呈迁移较快的模糊条带，由于单链 DNA 不能被绝大多数限制酶所切割，因而在对照和样品中这些带应一致。
3. 消化完全后，酚: 氯仿抽提，然后在 0.3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)存在下，用标准的乙醇沉淀方法纯化 M13 DNA。然后将 DNA 以50 μg/ml 的浓度溶于 TE ( pH 8.0)。
4. 如果需要，用小牛碱性磷酸酶或虾碱性磷酸酶处理，使线状载体 DNA 脱磷酸。脱磷酸反应结束后，用加热或用蛋白酶 K 消化使碱性磷酸酶失活，然后再用酚：氯仿抽提。
5. 用步骤 3 的方法回收线状 M13 DNA。将脱磷酸的 DNA 以浓度为 50 μg/ml 溶于 TE ( pH 7.6)。
用于克隆的外源 DNA 的制备
6. 独立的外源 DNA 限制性片段可通过适当的限制酶切和琼脂糖凝胶电泳纯化得到。制备的外源 DNA 以浓度为 50 μg/ml 溶于 TE (pH 7.6)。
连接
连接互补的黏性末端时，请按以下步骤 7~9。建立平末端连接反应，请看方案“在质粒载体中进行平末端片段的克隆实验”。
7. 在一个微量离心管（管 A ) 中，将约 50 ng 载体 DNA 和摩尔数 1~5 倍过量的目标 (外源）DNA 混合，混合体积不超过 8 μl。如果需要，加入 TE ( pH 7.6 ) 将体积调整至 7.5~8.0 μl。设立以下对照：
8. 在所有四个反应管中（管 A~D) 各加入 1 μl 10X 连接缓冲液和 1 μl 10 mmol/L ATP。
9. 在管 A、B 和 D 中各加入 0.5 Weiss 单位噬菌体 T4 DNA 连接酶。各管轻拍管壁数秒混合内容物。12~16℃ 连接反应 4~16 h。
转化
10. 用 YT 或 LB 培养基，37℃ 持续振荡制备过夜培养的铺板菌体。
11. 从 -70℃ 冰箱取一支带有 F' 质粒的所需菌株的感受态细胞，室温融化，置于冰上 10 min。
12. 在 16 支预冷至 0℃ 的 5 ml 无菌培养管（Falcon 2054, Becton Dickinson) 中各加入 50~100 μl 的 F' 细菌感受态细胞。
13. 立刻在含有感受态细胞的各培养管中分别加入连接反应产物和对照（管 A~D ) 各 0.1、1.0 和 5 μl。轻拍管壁数秒混合细菌和 DNA。冰上放置 30~40 min。另设两个转化对照，一个含 5 pg M13 噬菌体 RF DNA, 另一个不加 DNA。
14. 在连接的 DNA 与感受态细胞温育的同时，准备 16 支备含 3 ml 融化的 YT 或 LB 上层琼脂的无菌培养管，置于 47℃ 加热器或水浴上，直至步骤 16。
15. 将含有感受态细菌和 DNA 的培养管移至 42℃ 水浴，温育，立刻将培养管移回冰水浴。
转化细胞铺板
16. 在步骤 14 准备的含融化的上层琼脂的培养管中加入 40 μl 2% X-gal, 4 μl 20% IPTG 和 200 μl 过夜培养的大肠杆菌细胞（步骤 10), 温和振荡数秒混合内容物。 将各转化细胞分别加入各培养管中，加盖温和颠倒三次，依次将备管中的内容物倒至作好标记的 LB 琼脂平板，转动平板，使菌和上层琼脂铺均匀。
使上层琼脂在琼脂平板上完全铺平可能有些困难，特别是第一次使用大平板（直径 15 cm) 时。铺板前， 先将琼脂平板在 37℃ 预热 30~60 min，可以减慢上层琼脂凝固的速度（这样转动平板这一步就有更多的时间）。上层琼脂温度高于 47℃ 会杀死感受态细菌（并明显降低转化率）。
17. 盖上平板，室温凝固 5 min, 用 Kimwipe 纸巾吸干平板盖上的冷凝水，倒置平板，37℃ 培养。
