缩短蛋白质疗法的上游生物工艺时间（二）

  案例研究
    克隆筛选和早期工艺开发
    为了使自动化微型生物反应器成为可行的克隆选择和早期工艺开发模型，微型生物反应器培养的工艺参数、细胞增长和活性结果应与台式生物反应器的结果相似。为了确定这一点，用ambr15自动化微型生物反应器(3个复制品)、1L和3L玻璃台式生物反应器进行了比较。
    为了检测活细胞数(VCC)，在微型生物反应器、一个3L玻璃生物反应器(Applikon)或1L的DASGIP®生物反应器(Eppendorf)中采用补料分批工艺培养三个表达单克隆抗体的指定K1-3CHO克隆。在ZL细胞培养条件下培养细胞系10至14天。按照0.5x106活细胞/毫升接种培养物，每24小时取样，用于1L和3L生物反应器，每48至72小时取样，用于ambr生物反应器、离线pH、细胞数和代谢物测量。用Vi-CELL细胞活力分析仪(贝克曼库尔特)计算活细胞数(VCC)，在Vi-CELL测量前，用PBS缓冲液稀释(1:3vol/vol)来自微细生物反应器(0.25mL)的细胞，以减少取样容积。测量效价，用血气分析仪(西门子)测量pH、pCO2和DO的离线测量值，用NOVA 400(诺瓦生物医学)测量代谢物，例如葡萄糖、乳酸盐、谷氨酸盐、谷氨酸酯。
    细胞增长和生产率结果表明(图3和4)，在1L、3L台式生物反应器或ambr15自动化微型生物反应器中培养的三个CHO克隆均呈现相似的增长和效价曲线。

图3 在ambr15和3L玻璃生物反应器中培养的三个CHO克隆的生长和蛋白质表达曲线比较

图4 在ambr15和1L玻璃生物反应器中培养的三个CHO克隆的生长和蛋白表达曲线比较

    细胞代谢结果(图5)表明，在1L台式生物反应器或自动化微型生物反应器中培养的三个CHO克隆均呈现相似的pH和pCO2曲线。

图5 在自动化微型生物反应器和1L玻璃生物反应器中培养的三个CHO克隆的细胞代谢曲线比较

    数据支持之前的文献报告，ambr15微型生物反应器系统拥有高生产量，每次运行可使用24个微型生物反应器，能够以复制的形式实现多个相同的并联培养。使用手动控制的摇瓶或台式器皿很难达到该生产量，并且需要投入大量时间和资源，还有使结果出现变异性的风险。
    工艺放大
    对于早期工艺开发，ambr15系统适合用于模拟台式生物反应器条件，已发布的数据表明，ambr15可模拟2L至7L规模的台式生物反应器。对于工艺放大，ambr15也可用作关键参数的比较模型，例如：更大型反应器中的细胞增长和生产率。有一份研究报告称，在微型生物反应器、7L玻璃生物反应器(Applikon)、10L一次性生物反应器(通用电气医疗集团生命科学部)和200L一次性BIOSTAT®STR生物反应器(赛多利斯)的补料分批工艺中培养了一个表达单克隆抗体的CHO细胞系。按照0.5×10⁵活细胞/毫升接种细胞，在ZL细胞培养条件下培养细胞。按需要添加葡萄糖，对培养物进行试验11天。定期计算细胞数，进行最终收获后，分析总蛋白的数量，结果(表2)表明各类型生物反应器中使用了类似范围的效价。ambr15、7L玻璃生物反应器、10L一次性生物反应器和200L一次性生物反应器的增长曲线呈现较高的相似性(图6)。

图6 在ambr15、7L玻璃生物反应器、10L一次性生物反应器和200L一次性赛多利斯生物反应器中培养的CHO细胞系的增长曲线

    结合使用自动化微型和小型生物反应器系统可取代传统的摇瓶和台式生物反应器，并且优势众多：相对于图4 在ambr15和1L玻璃生物反应器中培养的三个CHO克隆的生长和蛋白表达曲线比较手动密集型基于振动器的系统，可提升数据质量、降低风险；提高生物反应器生产量；大幅缩短工艺开发时间(图7)；在工艺开发中研究更多的生物反应器条件(图7)，从而提高工艺生产率和/或产品质量。

图7 使用自动化微型和小型生物反应器的工艺开发

    结论
    ambr15自动化微型生物反应器系统准确模拟台式生物反应器的培养环境，生成相似的细胞增长、细胞代谢和蛋白质生产的结果。本文表明，赛多利斯一次性生物反应器ambr15能够为细胞的增长和活性放大到生产级别提供高度可能性。因此，这一微型生物反应器可取代摇瓶模型或传统台式反应器，在设置、操作、停工、清洁和杀菌工作中节约大量时间和金钱，同时仍保留扩展为大型生物反应器的可扩展性。由于该微型系统是全自动并且使用较小的细胞培养容积，科学家在相同的时间内可完成更多试验，使用更少的资源，例如培养基或补料，使其成为用于早期工艺开发的经济型高通量方法。
    结合使用自动化微型和小型生物反应器可取代传统的摇瓶和台式生物反应器。因此，生物工艺优化不再受到台式生物反应器的可用性、操作员时间或基础设施的限制，目前，ambr微型和小型生物反应器技术为减少蛋白质疗法的开发时间和生产成本做出了巨大贡献。