RNA实验方法附录
一、RNA抽提注意事项
尽可能无RNA酶的环境下操作，最好有专门场所
耗材的处理：
电泳槽需0.5 M NaOH处理过夜后DEPC水清洗
试管氯仿浸泡处理后DEPC水清洗
枪头和eppendorf管DEPC水浸泡后灭菌处理
实验者本身防护：一次性手套，口罩等
启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成
正确的操作方式
二、RNA操作常见问题分析
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
| 产量太低 | 样本裂解或匀浆不充分 | 延长匀浆时间 |
| RNA沉淀溶解不充分 | 65℃加热可促进溶解 | |
| A260/A280<1.65 | 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小 | 增加RNA抽提试剂用量 |
| 匀浆后，样本没有静置 | 室温静置5分钟，促进裂解反应 | |
| 水相中可能有酚残留 | 吸取上清时应注意操作的正确性 | |
| RNA沉淀溶解不充分 | 加热可促进溶解 | |
| 测比值时，RNA溶解在DEPC水中，低的离子浓度和PH值增加了280nm的吸光值 | 比值时，采用TE溶液溶解RNA | |
| RNA降解 | 取样操作不正确 | 取样后应立即抽提和冻存 |
| 样本保存不当 | －80℃或液氮保存 | |
| 液相中可能有RNA酶污染 | 采用RNA抑制剂 | |
| 制胶时所用甲醛的PH值小于3.5 | 试剂新鲜配制 | |
| DNA污染 | 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小 | 增加抽提液用量 |
| 蛋白、多糖污染 | 抽提时蛋白和多糖去除不彻底 | RNA沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀RNA |
三、确定RNA质量的常用方法
1） 检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。当R>1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA（不同的实验对RNA质量的要求不同）。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
2） RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的。但如果仅仅是为了检测RNA的质量，没有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA
smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。
3） 保温试验：确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中，用pH7.0的Tris缓冲液补充到10μl的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
四、RNA酶活性的控制
为了获得高质量的真核细胞mRNA， 必须使用RNA酶抑制剂或采用破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。
实验过程中，由于操作不慎，外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA：
（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽：
灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180
℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1
％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次，
并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972）。在15
lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸气灭菌15分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。
（２）研究人员造成的污染：
RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时，主有涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。
（３）污染的溶液：
用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1％DEPC于37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。
注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
RNA酶的抑制剂：
（１）RNA酶的蛋白质抑制剂：该抑制剂是从人胎盘分离的一种蛋白质，可与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50％甘油中，贮存于－20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用，因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此，在使用变性剂裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而采用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂，并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂，故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
（２）氧钒核糖核苷复合物：这种由氧钒（1V）离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物，是种过渡态类似物，它能与多种RNA酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。这４种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中，在RNA提取和纯化的所有过程中，其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译，
并能作为某些酶促反应（如mRNA反转录）的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译，因此必须用含0.1
％羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以除之。
（３）Macaloid（硅藻上）：Macaloid是一种粘土，很多年前就发现它能吸附RNA酶，用缓冲液将其制成浆液，以0.015％（W/V）的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中（如酚抽提后）经离心去除。
破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法：
用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等，因此可联用上述试剂，从组织中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整无损的RNA。
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