聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪载体的合成与性质

聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱仪的载体是聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH₂，简称Acr）和交联剂N，N′－甲叉双丙烯酰胺（CH₂ = CH－CO－NH－CO－CH = CH₂，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构。参与反应的催化剂有两种成分，一种是引发剂，提供原始自由基，通过自由基传递，使单体丙烯酰胺成为自由基，引发聚合反应；另一种是加速剂，加快引发剂释放自由基的速度。

一、合成：

聚丙烯酰胺凝胶的合成方式有化学聚合和光聚合。

  1、化学聚合：

引发剂过硫酸铵（AP）在加速剂N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）的催化下形成氧自由基，进而使单体丙烯酰胺形成自由基，从而引发聚合反应。

聚丙烯酰胺凝胺凝胶电泳中的分离胶（小孔胶）是通过化学聚合而成。

  2、光聚合：

引发剂核黄素在加速剂TEMED和光照条件下，分解成无色的还原型（无色核黄素），在少量O₂条件下，还原型核黄素被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合反应。但过量的氧会阻止链长的增加。

此法制得的凝胶筛孔大，常用作聚丙烯酰胺凝胺凝胶电泳中的浓缩胶。

  3、影响聚合的因素：

（1）大气氧能淬灭自由基，终止聚合反应，反应液应与空气隔绝。

（2）有些材料如有机玻璃能抑制聚合反应，在有机玻璃容器中，反应液和容器表面接触的一层不能形成凝胶。

（3）某些化学物质可减慢反应速度。

（4）温度影响聚合反应，温度高反应快，温度低反应慢。

二、性能指标：

聚丙烯酰胺凝胶的性能指标有凝胶总浓度和交联度等。

  1、凝胶总浓度（T）：

凝胶总浓度表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含量。

T = [（a+b）/m]×100%

式中：a为单体的质量（g），b为交联剂的质量（g），m为溶液的体积（mL）。

凝胶总浓度可在3%～30%之间变化。凝胶总浓度过高，凝胶硬而脆，容易破碎。凝胶总浓度过低，凝胶稀软，不易操作。

凝胶总浓度主要影响筛孔的大小。实验表明，凝胶筛孔的平均直径和凝胶总浓度的平方根成反比。

D＝kd/（T^1/2）

式中：D为凝胶筛孔的平均直径，d为多聚体分子直径，k为常数。

  2、交联度（C）：

交联度示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。

C = [b/（a+b）]×100%

交联度决定凝胶筛孔的zui大直径。

交联度过高，凝胶不透明，缺乏弹性。交联度过低，呈糊状。要获得透明而有合适机械强度的凝胶，单体用量高时，交联剂量应减少；单体用量低时，交联剂量应增大。

  3、良好的电泳用凝胶的经验公式：

在100mL溶液中，Acr（g）×Bis（g）≈常数（约1.3）

最常用凝胶的组成是T＝7%～7.5%，C＝2%～3%。标准凝胶的组成是T＝7.2%，C＝2.6%，用此凝胶分离蛋白质可得到较好的结果。

当分析未知样品时，常用标准凝胶或4%～10%的梯度凝胶试测，然后确定合适的凝胶总浓度。

用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖或在3%凝胶中加入20%蔗糖，以增加机械强度而又不影响凝胶筛孔大小。

三、特点：

  1、聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔大小可人为控制和调节，并且制备重复性好。

  2、聚丙烯酰胺凝胶是碳－碳结构，没有或很少带有极性基因，吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。

  3、凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果，且需要样量较少。

  4、用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。

四、应用：

聚丙烯酰胺凝胶特别适合作区带电泳的载体，用于酶分离和分子量测定。