暗示与关联条件恐惧(场景恐惧实验fcs)
暗示与关联条件恐惧（cued and contextual fear conditioning）是基于巴普洛夫条件反射而建立的。它测定动物学习、记忆不悦经历（aversive experience）和环境暗示之间关联的能力。常用声音或光暗示作为条件刺激（conditioning stimulus，CS），以厌恶性刺激（如足电击）作为非条件刺激（unconditioned stimulus，US），二者配对出现。经过这种CS-US训练，动物不仅学会声音和电击之间存在联系，而且知道电击和周围环境之间也存在某种联系（context）。前者为听觉暗示条件恐惧（auditory cue fear conditioning）或暗示条件恐惧（cued fear conditioning），后者为关联条件恐惧（contextual fear conditioning）。恐惧是非灵长类动物少有的几种情感反应之一。动物经历条件恐惧后，当再次接触条件刺激时，会产生一系列的生理反应，包括自主神经紧张、应激激素分泌增加以及防御行为增多，等等。凝滞（freezing）即是动物防御行为的一种，是指动物除呼吸之外没有任何其他活动，犹如在黑夜处于迎面而来的汽车强灯照射之下的惊鹿，一动不动。它被认为是评价啮齿类动物恐惧的可靠指标。
参与条件关联学习过程的脑部结构主要为杏仁核和海马。前者调节恐惧，后者调节与恐惧性事物相关联的学习认知。所以，这一模型主要用于杏仁核和海马依赖的记忆。动物不需要禁水或禁食，且实验设备较为简单，训练时间相对较短。因此，该模型广泛用于转基因小鼠敲除小鼠的行为表型研究。
一、实验设备
包括条件恐惧箱、隔音箱和关联条件箱，由上海欣软信息科技有限公司生产。条件恐惧箱包括与箱底格栅地板相联的电击发生器（可产生0.1~1.0mA的各种强度的电击）、声音发生器（可产生宽频的卡嗒声或低频音），并与计算机相联。隔音箱装有一灯、一小风扇（用于通风和产生背景音）以及一个与声音发生器相联的扩音器。隔音箱门上有一猫眼，用于观察操作箱内的动物。一个隔音箱内可放置两个操作箱，这样可同时观测两只动物，但两动物彼此不能互相看见。关联箱由透明有机玻璃制成，有可移动的格栅式地板和纱窗式顶部。为防止动物滑至格栅下面，格栅条之间距离应足够短。对小鼠和年幼大鼠，关联条件箱通常为26cm*21cm*10cm；格栅地板由不锈钢条（直径1.5mm，中央间距小鼠为0.5cm、年幼大鼠为1.2cm）组成。对成年大鼠，关联箱通常为29cm*23.5cm*19.5cm，格栅地板包括16根不锈钢条（直径2.5cm、中央间距为1.25cm）。此外，还有电压计和声强计，用来检测刺激强度。
实验方法
分为训练和测试两阶段
（一）训练阶段（第一天）
1．调试仪器，以确保格栅地板有电流刺激，扩音器有声音刺激，并分别记录电流强度和声音强度（分贝）。
2．将大鼠放入条件恐惧箱2min（A相），记录这最初2min内动物的凝滞（freezing）时间作基线。
3．接着加入卡嗒声，80Db,30s(B相)。
4．紧接着再给予电击，0.35mA，2s（C相），完成一轮训练。如需要多轮训练，则重复A、B、C三相训练即可。
5．记录整个训练阶段动物凝滞时间（s），用以测量动物的非条件恐惧（unconditioned fear）。
6．将大鼠移开操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液彻底清洁操作箱，以备进行下一批动物的训练。
（二）测试阶段
在训练后的第二天进行，包括关联（context）测试、变更关联（altered context）或条件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）测试以及条件刺激（conditioning stimulus，CS）测试。测试阶段没有电击刺激。关联测试和变更关联测试中也没有听觉条件刺激，但每只动物所用的操作箱应与训练阶段的相同。
1．关联测试 将动物放入箱内，计算机自动记录动物的凝滞行为。若用人工观察，则观察者（应不知道动物的处理或基因型）用静声秒表通过箱门上的猫眼（小窗口）观察动物的行为并计分：凝滞为1分，活动（moving）为0分（也有只记录凝滞时间）。每10秒观察一次，共5min，这样可记录到30次（bout）可能的凝滞（即最大凝滞得分为30分）。用在这一阶段记录到的、动物在同一操作箱内的凝滞时间测量动物的关联条件恐惧（contextually conditioned fear）。此为关联测试。观察结束后将动物放回笼内，清洁操作箱，进行下一只动物的观察。
2．变更关联测试和听觉条件刺激测试 关联测试1h后进行。操作如下：
（1）将计算机调至所需程序。
（2）操作箱进行如下改造：1用平滑塑料板取代关联条件箱内的格栅地板；2在箱的对角线加一块有色塑料板，这样将长方体的操作箱变成三角体；3改变嗅觉暗示（olfactory cues）。例如，可在箱的一角放一个装有一滴桔子汁或柠檬汁的杯子，或直接将一滴果汁涂于墙上。然后开始变更关联和听觉条件刺激实验。
（3）将动物放入经改造后的关联箱（从关联实验中的第一只动物开始）。
（4）启动预置的实验程序，每隔10秒记录动物的凝滞和非凝滞得分（分别为1和0分），共记录3min，即18次可能的凝滞记录（凝滞得分为18）。
（5）加入听觉条件刺激30秒。重复上述记录3分钟。
（6）将动物放回笼子，清洁操作箱，进行下一只动物的测试。
三、结果计算与分析
因为不同类型的学习凝滞时间不同，所以最常使用百分计：
关联=（关联测试中的凝滞得分/30）*100%
变更关联（条件刺激前）=（变更关联中的凝滞得分/18）*100%
听觉暗示（条件刺激）=（听觉条件刺激中凝滞得分/18）*100%
对每一不同的凝滞测试计分进行重复测量单因素方差分析（ANOVA），从此比较关联和变更关联或听觉暗示之间的条件恐惧程度，并确定组间差异。一般而言，动物在听觉暗示中的凝滞行为要比关联测试的多。在变更关联测试中，由于关联条件箱已被改造得“面目全非”，训练时动物获得的对周围环境的关联几乎不存在，因此，凝滞行为应该最少。关联与变更关联差别很大，凝滞计分差别越大。
如果动物在第二天的关联测试和听觉暗示测试中出现凝滞，而在变更关联测试中不表现凝滞行为，则可认定：动物的感觉和运动功能均正常；能记住前一天与厌恶刺激配对出现的暗示信号；能分辨前一天不与厌恶刺激配对出现的暗示信号，说明动物具有正常的记忆。这些测试中的任何一项增强或减弱，提示调节记忆情感部分的神经解剖、神经递质和基因可能发生变化。
四、注意事项
1．动物对电击的反应部分地取决于非条件刺激的电击强度和痛#。当动物（尤其是基因改变的动物，如转基因或基因敲除小鼠）不能学会关联条件反射时，可能是电击强度不够或痛#偏高所致。对条件反应程度与电击强度进行比较分析，可排除对电击强度因素的疑虑；对刺激电流强度（0.1~0.7mA）与反应作一“量-效曲线”，可评价动物的痛#或对电击的敏感性。此外，格栅地板若沾有动物的排泄物也可改变电刺激强度。因此，应保持格栅地板的清洁与干燥。
2．由于老年动物听力减弱甚至丧失，对听觉暗示可能反应迟钝或无反应。此外，有些品系的小鼠，即使在成年早期，对高频音刺激的反应尤其减弱。因此，用这一模型测定老年动物或某些品系的小鼠时应特别谨慎，并避免用高频音刺激。
3．要使动物在关联测试中表现凝滞行为，必须让其在操作箱内有适当的时间。应避免将动物放入箱内便立即给予电刺激，因为这样动物没有时间在电击与箱内环境（关联）之间形成联系。
4．观察者必须快速、准确地判定动物是否表现凝滞行为，而不应在整个10s观察期间死盯着动物，以免动物在这10s间隙活动而导致计分不准。不同观察者应用同一种方法计分，两名观察者计分之间的相关系数应在0.98以上。同样地，当采用自动计分系统进行计分时，应对系统进行调节，使之与人工方法计分相比，两者的相关系数在0.98~1之间。
5．在本实验中，先测试关联学习，再测试暗示条件反应。在关联测试中没有听觉暗示刺激，因此，动物在暗示条件测试时对听觉刺激的反应有可能发生消退（extinction）。理论上，这种听觉暗示反应可能减弱。为消除这种实验偏差，将其中一半动物先测试听觉暗示反应，一小时后再检查关联条件反应。
6．实验分两天进行。训练和测试应在每天的同一时间进行。测试（凝滞计分）所花的时间比训练要长的多，因此，同一批训练的动物不宜过多。
7．暗示和关联两种条件恐惧可表现出发育差异和基因差异。例如，年龄在18天的大鼠有听觉条件恐惧，但极少有关联条件恐惧；而到23天时，关联和听觉暗示条件恐惧都有。有些品系的小鼠（如DBA/2小鼠）只有很弱的关联条件恐惧，但听觉条件恐惧却很好。
8．对有些基因型动物，如果预先让其短暂适应关联条件，关联学习会得到改善。一般认为这与海马功能增强有关。这种适应通常在训练前一天进行，而且时间很短（30~60s）。
9．暗示条件恐惧由侧杏仁核调节，而关联条件恐惧由杏仁核和海马共同介导。毁损这些脑区可削弱或阻断暗示与关联恐惧条件反射。
