RNAi实验原理与方法选择（一）
一、RNAi的分子机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。
另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何进行RNAi试验
(一)siRNA的设计
1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.RNAi目标序列的选取原则：
(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到：
http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html
http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html
http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published
二)siRNA的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。
1． 化学合成生产siRNA
优点：方便，研究人员几乎不需要做什么工作。
缺点：价格较贵，效率只有转录合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持续时间短，对细胞毒性大，转染效率低，此外由于合成工艺上存在不可弥补的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能纠正合成中产生的20%左右的碱基错误。
适用于：建议不再采用此种合成方法。
不适用于：基本上对目前所有的实验室来说均不适用。
评价：☆☆☆☆☆
2． 生物合成转录生产编码siRNA
优点：价格较低，抑制效率高，低浓度的siRNA即可达到抑制效果。体外转录合成，比较接近生理状态。
缺点：无法保证有效性，实验规模受到限制，不能进行大量的生产，不能维持长时间抑制效应，而且需要用户参与操作，难以保证实验的一次成功性。
适用于：筛选siRNAs特别是需要制备多种siRNAs，考虑合成价格时。
不适用于：实验需要大量的一个特定的siRNA。长期研究。
评价：★★★☆☆
