5分钟超快速定量蛋白质组学研究COVID-19感染分级标志物

2020年9月11日 17:30:24 来源: SCIEX
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  视频提要:本视频由弗朗西斯·克里克研究所Markus Ralser博士录制,简要回顾代谢通路研究的内容和方法,重点介绍其团队建立的5分钟超快速蛋白质组学工作平台,使用SCIEX TripleTOF™质谱系统及SWATH®采集技术。Markus Ralser博士也展望Scanning SWATH® 采集方法未来在超快速蛋白质组学应用中的优势,包括扫描速度更快且蛋白质鉴定准确性更高。他们在实验室尝试了更极限的1分钟甚至30秒的高速液相梯度,Scanning SWATH 采集方法依然能够鉴定到1000个左右蛋白质。视频中涉及SCIEX产品及技术包括:TripleTOF™ 6600系统,SWATH 采集技术、Scanning SWATH 采集技术。

  Markus Ralser 博士是代谢研究领域的专家,目前担任德国柏林夏里特医学院生物化学研究所 (Charité-Universitätsmedizin Berlin) 和英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所(Francis Crick Institute)代谢分子生物学实验室主任。Markus Ralser博士课题组的研究方向主要是基于对细胞稳态和对外界刺激反应的研究来更好地了解代谢过程和发现药物开发的潜在靶点。由于实验中需要对大批量的样本进行蛋白质组学的定量分析,因此Markus Ralser博士课题组与SCIEX 建立了长期的合作,共同构建稳定、快速、高通量的实验平台。

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图1:弗朗西斯·克里克研究所Markus Ralser博士在Cell Systems杂志在线发表文章,介绍其通过超高通量临床蛋白质组方法研究新冠肺炎感染患者的潜在27个蛋白质分级标志物(图片来源:Messner et al., 2020, Cell Systems 11, 11–24. )

  近期,Markus Ralser博士课题组在Cell Systems (细胞系统, 简称 CELL SYSTM) 杂志上发表了一篇题为”Ultra-High-Throughput Clinical Proteomics Reveals Classifiers of COVID-19 Infection ”(超高通量临床蛋白质组揭示新冠肺炎感染分级标志物) 的文章。文章基于SCIEX 特有的SWATH 采集模式搭建了一套适用于大批量临床样本检测的超高通量蛋白质组学定量平台。该平台使用常规分析型液相色谱搭配SCIEX TripleTOF™6600系统,在SWATH采集模式下实现了5 分钟完成一个临床样本的蛋白质组学定量工作。因此,该平台每天可以进行超过180个样本的检测,极大减轻了COVID-19病毒大流行时期的样本检测压力,能够帮助更快更准地筛选出潜在的治疗靶点。因此,超高通量蛋白质组学定量平台的应用将蛋白质组学从研究工具转变为快速反应并可适应传染性疾病暴发的临床技术。

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图2:本图描述从样本收取、贮存、前处理到质谱采集和数据分析的流程,涉及SCIEX TripleTOF™ 6600系统(图片来源:Messner et al., 2020, Cell Systems 11, 11–24. )

  那么,SWATH采集技术是如何来实现如此快速、稳定、高通量的蛋白质组学定量检测的呢?

  SWATH 采集技术是一项非数据依赖型(DIA)数据采集技术,在采集TOF MS/MS二级谱图时, Q1(四极杆)按照方法设定好的固定窗口或可变窗口,将设定的质量范围划分成几个或几十个小的质量范围,然后将这些小的质量范围依次传输到Q2(碰撞池)中进行碎裂,获得该质量范围内所有母离子的碎片信息,继而定量到更多的蛋白质。来自于全球十多个实验室的科研人员在各自的实验室内使用SWATH 采集技术进行数据采集,实验室之间的高度一致的实验结果有力地证明了SWATH 采集技术具有很好的重现性(Collins et al, Nat Commun. 2017 Aug: 8(291))。

  因此,SWATH采集技术是一种非常适合于进行生物学研究以及临床研究的数据采集技术。而且,SWATH 采集技术高质量、高稳定性的数据结果,可以实现在保证选择性的前提下将采集时间进一步缩短,从而提高检测通量。Markus Ralser 博士在文章中对5 min超短梯度下SWATH 采集数据的稳定性进行了考察。如图1所示,对患者血浆样本进行10次重复采集后,第一次进样和第十次进样能够保持很好的一致性。而且,实验证明,在连续采集的409个样本中,245个蛋白具有87%的数据完整性,182个蛋白具有99%的数据完整性。由此,基于SWATH 采集模式的超高通量蛋白质组学定量平台的数据稳定性和准确性都得到了很好的验证。

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图3: 左图为SWATH 采集技术重现性考察。基于超快速SWATH 采集方法对血浆样品进行十次重复实验,将第一针总离子流图(蓝色曲线)与第十针总离子流图(红色曲线)重叠,可见该方法具有很好的重现性。左图中还展示了十针重复后采集的空白样品总离子流图(黑色曲线),以此证明该方法不存在交叉污染的风险。右图对409个样本的定量结果进行了统计分析, 245个蛋白具有87%的数据完整性,182个蛋白具有99%的数据完整性。(图片来源:Messner et al., 2020, Cell Systems 11, 11–24.)。

  为了获得更深度、更完整的覆盖结果,Markus Ralser博士课题组又将SCIEX新推出的Scanning SWATH 采集技术运用到了超高通量的蛋白质组学的定量平台中。Scanning SWATH 采集技术是SCIEX与瑞士苏黎世联邦理工学院共同开发的成果。区别于SWATH 采集技术中Q1分段的质量范围选择和传输方式,Scanning SWATH 采集技术中Q1会按照一定的窗口大小(一般为3 Da、5Da或者10Da)在扫描质量范围内连续滑动 (如图2所示)。因此Scanning SWATH 采集可以做到更小的质量隔离窗口,提供更好的谱图的专属性。同时,由于四极杆的特点决定,质量窗口越小,灵敏度越高。而且Scanning SWATH 采集技术的Q1可以达到3000 Da/s的扫描速度,因此可以设置更小的循环扫描时间更加适合于快速液相方法。

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图4:SWATH 和Scanning SWATH 采集技术在1个循环 Q1扫描方式不同:SWATH 采集方法中Q1按照方法设定好的固定窗口或可变窗口,将设定的质量范围划分成多个窗口,每个窗口之间都由1 m/z重叠(左上图);Scanning SWATH 采集方法中Q1会按照一定的窗口大小在扫描质量范围内连续滑动(左下图)。两者均可以提供保留时间信息(右上)。而Scanning SWATH 采集方法中特定母离子被Q1扫描窗口覆盖到的起点和终点各不相同,因此还可以提供Q1维度的信息(右下图)。(图片来源:Messner et al., Doi: http://dx.doi.org/10.1101/656793 )。

  基于Q1连续滑动这一基本原理,Scanning SWATH 采集技术除了可以提供保留时间(RT)、每个Q1窗口的碎片离子和每个碎片离子的强度这三个维度的信息以外,还可以提供第4个维度信息,即碎片离子和母离子的相关性。这是因为在Q1 连续滑动的过程中,Q1的扫描范围会有重合的母离子区域,不同质核比的母离子所产生的碎片离子将会在Q1不同采集区域内出现和消失。通过数据算法,就可以精准的建立碎片离子和母离子的相关性。Markus Ralser博士在讲座视频中介绍到,新增的Q1维度信息将使Scanning SWATH 采集技术的数据能够更准确地判断碎片离子的归属,降低假阳性(如图3所示)。另外,在数据处理的过程中,引入了Q1维度信息进行打分,可以获得更多的母离子信息,其FDR<1%的比例也明显提高。

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图5: 左图展示了Scanning SWATH 采集结果中母离子的FDR(假阳性率)分布情况(红色圆点表示引入Q1维度信息的分布结果,蓝色圆点表示未引入Q1维度信息的分布结果),由此可见Q1维度信息使得定量结果更加可靠。右图对比了真实存在与假阳性两种情况下子离子的出峰情况,Q1维度信息可以提供特定母离子的子离子出峰位置(即图中虚线表示的位置),以此来判断碎片离子的归属,降低假阳性。(图片来源:RUO-MKT-17-11866-A. https://sciex.com/videos/Ultra-high-throughput-proteomics-In-COVID-19-research)。

  因此,Scanning SWATH 采集技术可在短时间内产生四维数据信息,为母离子和碎片离子之间的相关性提供更多信息,提高了定性和定量的可信度。另外,它也是一种永久保存样品的有效手段,可以创建包含大量一、二级扫描产生的数据记录。在蛋白质组学、代谢组学和其它组学研究中,Scanning SWATH 将助力客户开展精准医学研究。当然,Scanning SWATH 能够获得如此优秀的实验结果,Triple TOF™ 6600+系统的硬件支持必不可少。

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  TripleTOF™ 6600+系统是一款专为定量分析而研发的高分辨质谱,可以配备OptiFlow™离子源和接口,让用户在常规分析流速、微升流速和纳升流速之间根据实验条件任意切换,并且不会打破真空状态,大幅提升这款产品的灵活性。升级的SteadSpray™探针电极技术使低流速检测方法可以轻松实现,同时全新的硬件设计提高了仪器的抗污染能力,从而延长仪器稳定运行的时间。更重要的是, TripleTOF™ 6600+系统提供了3000Da/s的Q1扫描速度,同时TOF提供了200 赫兹的SWATH®采集扫描速度以及更宽的线性范围,确保了Scanning SWATH®采集模式下能够获得更好的数据结果。



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