摘 要：随着生物分子光学标记技术的不断进步，光学技术在揭示生命活动基本规律的研究中正发挥越来越重要的作用，也为医学诊断与治疗提供了更多、更有效的手段。本报告首先简要介绍光学技术在生物医学应用中的发展概况，然后从基因表达及蛋白质—蛋白质相互作用研究方面，讨论生物分子光学技术的特点与优势，阐明基于分子光学标记的光学成像技术是重要的实时在体监测手段，最后讨论光学成像技术在组织功能/脑功能成像中的应用原理与现状。
关键词：光学技术、生物医学、医学诊断与治疗、分子光子学、医学成像
一、生物医学光学发展概况
生物医学光学（Biomedical Optics）是近年来受到国际光学界和生物医学界广泛关注的研究热点，在生物活检（使用光学相干弱层析成像技术——OCT）、光动力治疗（PDT）、细胞结构与功能检测（运用激光共焦扫描显微镜）、基因表达规律的在体观测（运用荧光基因标记技术）等问题上取得了可喜研究成果，目前正在从宏观到微观多层面上对大脑活动与功能进行研究。Science在最近几年已发表相关论文近20篇。随着光学技术的发展，生物医学光学将在多层次上对研究生物体特别是人体的结构、功能和其他生命现象产生重要影响。
二、生物分子光学技术
细胞重大生命活动的发生和调节是通过生物大分子间（蛋白质—蛋白质、蛋白质—核酸等）相互作用来实现的。深入研究基因表达及蛋白质—蛋白质相互作用不仅能揭示生命活动的基本规律，同时也能深入了解疾病发生的分子机制，进而为寻找更有效的药物分子、提高药物筛选和药物设计的效率提供新的思路。
（一）现代分子生物学在研究基因表达和蛋白质—蛋白质相互作用中的局限性
现代分子生物学技术的迅速发展，特别是随着后基因组时代的到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞和动物模型，为在体研究基因表达规律、分子间的相互作用、肿瘤细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物学条件。
然而，尽管人们利用现有的分子生物学方法，已经对基因表达和蛋白质—蛋白质相互作用进行了深入、细致的研究，但仍然不能实现对蛋白质和基因活动的实时、动态监测。在细胞的生理过程中，基因、尤其是蛋白质的表达、修饰和相互作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获到蛋白质和基因的这些瞬时、动态、可逆的变化，但获取这些信息对与研究基因的表达和蛋白质—蛋白质的相互作用又至关重要。因此，发展能用于活体、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活动的方法非常必要。
光学成像技术与分子生物学技术的结合为研究上述科学问题提供了现实与可能。因此，在现代分子生物学技术基础上，急需发展新的成像技术。在活体动物体内，如何实现基因表达及蛋白质—蛋白质相互作用的实时在体成像监测是当前迫切需要解决的重大核心科学技术问题！这是也生物学、信息科学（光学）和基础临床医学等学科共同感兴趣的重大基础问题。对这一科学问题的研究不仅有助于阐明生命活动的基本规律、认识疾病的发生发展规律，而且对创新药物研究、药物疗效评价以及发展疾病早期诊断技术（光子医学诊断技术）等产生重大影响。
（二）基于分子光学标记的光学成像技术是重要的实时在体监测手段
光学成像技术正成为实时在体研究分子间/分子内蛋白质—蛋白质相互作用、离子通道、细胞膜蛋白及相关信号转导、生化底物及酶转运等的重要手段，由于具有高时间、空间分辨率，比现有其他手段更为直接，因而可望成为后基因组时代新药靶发现和高通量药物筛选的新方法。
表1和表2分别给出了目前处于研究和应用阶段的几种主要成像技术的应用场合及参数比较。比较相关参数可以看出，基于分子光学标记的光学成像技术已经在活体动物体内基因表达规律方面展示了有较大的优势。
例如，正电子发射断层成像（PET）可实现对分子代谢的成像，空间分辨率：1-2mm，时间分辨率：分钟量级。与PET比较，光学成像的应用场合更广（可测量更多的参数，请参见表1），且具有更高的时间分辨率（秒级），空间分辨率可达到微米。因此，二者比较，虽然光学成像在测量深度方面不及PET，但在测量参数种类与时空分辨方面有一定优势。对于小动物（如大鼠）研究来说，光学成像技术可以实现小动物整体成像和在体基因表达成像，例如，初步研究表明，荧光介导层析成像可达到近10cm的测量深度（Nature Reviews 2002）；基于多光子激发的显微成像技术可望实现小鼠体内基因表达的实时在体成像（Nature Medicine 2001）。
表1 主要成像技术及应用场合（Nature Reviews 2002）
成像方法
主要应用场合
磁共振成像（MRI）
高对比度，用于表型、生理成像和细胞跟踪的最好的全方位成像系统。
计算机层析成像（CT）
肺和骨癌成像
超声成像
血管和介入成像
正电子发射断层成像PET
分子代谢，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像
单光子发射断层成像SPECT
探针，如抗体，肽等的成像
荧光反射成像FRI
表面肿瘤分子事件的快速成像
荧光介导层析成像FMT
对深部肿瘤靶向标记或“灵活的”荧光染料标记进行定量成像
生物发光成像BLI
基因表达，细胞追踪成像
活体显微成像
以更高分辨率实现上述所有参数成像，但测量深度和范围有限。
虽然在体光学成像技术在时/空分辨、实时、动态和多参数测量等方面有一定的优势，但仍然有大量的技术问题需要研究。例如，从光学标记角度看，如何针对所要研究的体系和对象，为实现在活细胞和动物体内监测基因表达及蛋白质—蛋白质的相互作用，发展特异性更高、更易于光学测量的核酸和蛋白质探针，是当前要解决的关键技术问题之一。
表2 常用成像技术及参数比较（Nature Reviews 2002）
成像方法
空间分辨率
时间分辨率
测量深度
造影剂
价格
MRI
10-100m
Min/hrs
无限制
钆，镝和氧化铁离子
$$$
CT
50m
Min
无限制
碘
$$
超声
50m
Min
mm
微型气泡
$$
PET
1-2mm
Min
无限制
18F，11C，15O
$$$
SPECT
1-2mm
Min
无限制
99mTc（亚稳态锝）, 111In（铟）
$$
荧光反射成像FRI
1-2mm
Sec/min
<1cm
荧光蛋白，近红外荧光染料
$
荧光介导层析成像FMT
1-2mm
Sec/min
<10cm
近红外荧光染料
$$
生物发光成像BLI
几mm
Min
cm
萤光素
$$
活体显微成像
1m
Sec/min
<400m
荧光蛋白，发光蛋白，近红外荧光染料
$$$
其中：$表示价格<10万美元；$$表示价格在10-30万美元之间；$$$表示价格>30万美元
表3简要介绍了近几年发展十分迅速、正受学术界高度关注的几种研究活细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的光学成像技术的基本原理与特点，主要包括荧光共振能量转移（FRET）、荧光寿命成像（FLIM）、荧光漂白后恢复（FRAP）、荧光漂白后定位（FLAP）、荧光关联谱（FCS）和成像关联谱（ICS）等。如何发展和整合相关的成像方法，并应用于在体成像，为基因表达和蛋白质—蛋白质相互作用研究提供更先进的手段，也应是本项目研究的关键技术问题。
在数据处理与可视化研究方面，也存在重大的科学问题。例如，对于600微米左右的荧光，虽然可以穿透较厚的组织而被探测到，但由于经过了多次散射，如何定位发光位置，需要根据生物组织中的光子传输规律，通过图像重建算法来实现，事实上这方面的研究已经成为学术界的研究热点。例如，基于成像测量（包括光学成像）的分子与细胞事件动力学过程的可视化研究被评为2002年Science的十大突破之一（Science, Dec.20, 2002）。
表3 活体细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的实时在体光学成像技术
名称
原理与应用
荧光共振能量转移FRET—Fluorescence Resonance Energy Transfer
供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。FRET可用于测量分子内部间距，或蛋白质的不同反应活性部位、模型系统中的蛋白质与脂质、或细胞表面蛋白质等分子之间的距离。即可测量分子间的接近度，距离，方位和动力学特性。由于FRET效率与供体受体间的距离成6次幂的关系，所以FRET效率对距离的变化非常灵敏，可以灵敏测量10Å-100Å范围内的距离变化。
荧光寿命成像FLIM—Fluorescence Lifetime IMaging
荧光寿命成像显微镜和寿命测量与荧光浓度或激发强度的变化无关，FRET与FLIM的结合可提供高的空间（纳米）和时间（纳秒）分辨率。通过供体寿命测量和处理时间分辩图像，可精确计算相互作用的蛋白质间的距离。由于只测量供体荧光寿命，在FRET—FLIM成像中，可不考虑光谱的交叠问题。
荧光漂白（后）恢复 FRAP—Fluorescence Recovery After Photobleaching
FRAP是研究蛋白质动力学的重要工具。在FRAP实验中，利用激光脉冲有针对性对被荧光蛋白标记的细胞内的一个小区域快速、不可逆地漂白。该漂白区域完全没有荧光信号。然后使用延迟显微镜测量荧光信号随时间的恢复情况。荧光的恢复是由未漂白的分子流入被漂白区域所造成的。因此荧光信号恢复的动力学过程含有了被标记蛋白的表观迁移信息。
荧光漂白（后）定位 FLAP—Fluorescence Localization After Photobleaching
FLAP是在活细胞内对特定分子的光学标记进行定位和跟踪的新方法。被定位的分子包括两个荧光基团：一个被漂白，另一个则作为参考标记。与荧光漂白后恢复（FRAP）和荧光漂白中的损耗（FLIP）技术不同，利用参考荧光基团，通过简单的图像差异，即可跟踪光学标记分子自身的分布。因此，FLAP实际上可与光敏化方法相对比。与笼锁荧光探针方法相比，其主要优点是可用于跟踪细胞直接表达的嵌合荧光蛋白。
荧光关联谱 FCS¬—Fluorescence Correlation Spectroscopy
FCS可用于分析小规模分子集合辐射行为所引起的微小的自发扰动，从而反映分子内与分子间的动力学过程。由于FCS可观察纳摩尔（nanomolar）范围的荧光分子，因而可在大的空间与时间范围内，非常近似地模仿不同过程中的实际生理条件，如结合与离解反应，生化底物的转运、酶的周转，分子内（如结构）的动力学过程等。FCS的时间分辨率也可以达到纳秒（ns）量级。
成像关联谱 ICS—Imaging Correlation Spectroscopy
ICS为测量活细胞表面分子内相互作用的动力学过程提供了一种新的方法，还可以帮助阐明细胞膜上蛋白质的联合是如何激活信号转导通道的。ICS可测量分布在细胞表面的单个分子的密度、分子群、有组织的结构或功能区。该技术可探测单个分子的空间分辨率约为200平方微米。由于与分子的总数目有关，因此可用于估计单分子实体（molecular entity）中的平均分子数目。
国际同行对动物活体内基因表达与蛋白质—蛋白质相互作用的在体光学成像研究也非常重视。例如，美国NIH已经召开过三次研讨会，认为新的在体生物光子学方法可用于癌症和其它疾病的早期检测、诊断和治疗。新一代的在体光学成像技术正处在从实验室转向癌症临床应用的重要时刻。在NIH的支持下，NCI（美国国家癌症研究所）正在计划5年投资1800万美元，招标建立“在体光学成像和/或光谱技术转化研究网络（NTROI）”，其研究内容主要包括：光学成像对比度的产生机理、在体光学成像技术与方法、临床监测、新光学成像方法的验证、系统研制与集成等五个方面。美国NIH于2000年底成立了的国家生物医学影像与生物工程研究所（NIBIB）,在其首批支持的项目中，光学成像方法约占30%。2000年7月，美国NIH投资2000万美元，开展小动物成像方法项目（SAIRPs）研究，受到生命科学界的高度关注，其中光学成像方法也是其中的研究重点之一。NSF 在2000-2002年发布了四次Biophotonics Partnership Initiative 招标指南，呼吁开展多学科的合作研究。
（三）研究热点与发展趋势
从前面的讨论中可以看出，研究热点与发展趋势应包括如下三个方面：
1. 生物分子的光学标记新技术研究。针对所研究的体系和对象，发展具有高度特异性的、可用于生物体内活体成像的核酸和蛋白质探针。例如研制新的发光蛋白用于动物模型体内，实现蛋白质在动物体内的表达成像研究；设计并合成新型的具有高特异性的核酸探针，实现基因转录调控的活体监测；发展在活体细胞内监测蛋白质—蛋白质的相互作用的新方法；发展新的表面修饰和标记方法，将荧光纳米颗粒作为探针，用于活体细胞和动物器官的基因表达和蛋白质—蛋白质实时在体光学成像研究。
2. 在体光学成像新技术与应用研究。针对不同的研究对象和应用目标，发展各种新型的在体光学成像技术。例如实现小动物体内深部目标探测的扩散光学成像方法；实现动物体内药代动力学和药理学过程的实时在体成像监测的相干域光学成像方法；实现对动物体内基因表达和分子间相互作用过程在体成像监测的多光子荧光等非线性光学成像方法；实现不同层次多参数测量的集成化在体光学成像系统；以及无须外源性标记的各类在体功能成像方法等。应用研究包括：a) 以小动物为研究对象，在动物体内不同部位（如肺、肝、脑等）的肿瘤模型或其它疾病模型基础上，研究在体基因表达规律，监测肿瘤发生发展的动力学过程；对活体动物体内分子与细胞事件进行定量成像研究，例如通过荧光标记蛋白的互补与重组策略，结合生物发光光学成像技术，可以实现对活体内蛋白质—蛋白质相互作用的定量无损成像，从而有望提供一种有潜在价值的工具，对研究处于自然在体状态环境下的细胞内的蛋白质—蛋白质相互作用、对以调节蛋白质相互作用为靶标的新药的在体评估都具有非常重要的意义。动物组织、器官到整体水平的在体光学成像可望为研究药物作用靶点和评价药物作用效果提供重要技术手段。b) 以小动物体内的活细胞为研究对象，用光学成像技术，实时在体研究细胞内基因表达与分子间相互作用的动力学过程。例如，可文中提到的FRET、FLIM、FRAP、FLAP等技术研究蛋白质分子间的相互作用、计算蛋白质间的作用距离、特定分子在细胞内移动、定位与跟踪，以及蛋白质的构像变化等；运用FCS技术，在较大的空间与时间范围内，研究不同分子的结合与离解反应，生化底物的转运、酶的周转，以及分子内（如结构）变化的动力学过程等；运用ICS技术研究活细胞表面分子内相互作用的动力学过程，研究细胞膜蛋白的联合及其与信号转导通道的激活关系等。
3. 数据处理、图像重建与可视化方法研究。在光学成像检测的基础上，还需要开展数据处理、图像重建与可视化方法研究。主要是根据光子传输规律和光学检测模式，对所获得的数据进行处理和可视化研究。
三、医学光学成像技术
医学光学成像技术从理论上可分为扩散光学成像与相干域光学成像，前者成像深度较深，理论基础是光子输运方程的扩散近似，被检测的光学信号会在组织体内经历多次散射，如何建立散射信息与组织光学特性参数变化间的关系和提取散射信息是其关键；后者成像深度主要在组织浅层，散射影响较小，如何避免散射和在强散射背景中提取有用的结构与功能信息是其关键。
四、结论
生物医学光学是新兴交叉学科。光学技术为揭示生命活动的基本规律、临床医学诊断与治疗提供了新的技术手段和方法，同时，生命科学的发展，也不断对光学技术提出新的要求，促进了光学技术的发展。
