原位PCR技术
除了经典的原位杂交外。原位杂交可与其他组织化学技术相结合，或与其他分子生物学技术相结合，使其应用范围扩大，成为更有应用价值的技术。
PCR技术是根据生物体内DNA复制的特点而建立的在体外经酶促反应将特定DNA序列进行高效和快速扩增的技术，它可将单一拷贝或低拷贝的待测核酸以指数形式扩增而达到用常规方法可以检测的水平，但不能进行组织学定位。原位PCR（in situ PCR）技术由Hasse等人于1990年建立，是将PCR的高效扩增与原位杂交的组织学定位相结合，在不破坏组织细胞形态结构的前提下，利用原位完整的细胞作为一个微反应体系来扩增细胞内的靶序列，在组织切片、细胞涂片或培养细胞中来检测和定位微量核酸。
原位PCR技术的基本原理与液相PCR的扩增原理相似，即在耐热的DNA聚合酶作用下，以合成的DNA作为引物。经过加热（变性）、冷却（退火）、保温（延伸）等改变温度的热循环．使特异性靶序列DNA产量以2”倍的方式扩增。原位PCR是先将细胞或组织进行固定和酶消化处理，以保持组织细胞的良好形态结构。使细胞膜和核膜均具有一定通透性，再滴加PCR反应所需的各种试剂于样本上。然后将载有细胞或组织的玻片放入原位PCR仪上进行扩增反应。其结果可在显微镜下直接观察或用标记探针进行原位杂交后再用显微镜观察。根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否标记。原位PCR可分为直接法和间接法两类以及原位逆转录PCR。
1．直接法原位PCR 在反应体系中使用标记的三磷酸核苷酸或引物，在标本进行PCR扩增时，标记物掺入到扩增产物中。通过显示标记物，可原位显示靶DNA或RNA，扩增产物可直接观察而无需进行原位杂交。目前常用的标记物有地高辛、FITC和生物素等。该方法的优点是使扩增产物直接携带标记分子，因此操作简便省时，但特异性较差，扩增效率较低，易出现假阳性．特别是在组织切片上，假阳性信号主要来自标本中受损DNA的修复过程。由于固定、包埋及制片过程均可造成DNA损伤?受损的DNA可利用反应体系中的标记dNTP进行修复。这样，标记物则掺人到非靶序列DNA分子中，产生假阳性。另外，引物与模板的错配也可导致假阳性信号的产生。在直接原位PCR的基础上建立的5，端标记引物原位PCR方法，虽然也有上述非特异性修复和扩增现象，但由于无标记物的掺人，故非特异性产物虽可以产生却无法显示，从而避免了假阳性结果。
2．间接法原位PCR 是先将引物、核苷酸及酶等反应物引入细胞内进行扩增，然后用特异性标记探针与扩增产物进行原位杂交?检测细胞内扩增的DNA产物。该方法能克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性染色问题，使扩增效率提高，特异性增强，故是目前应用zui为广泛的原位PCR方法。该法需在扩增反应后再进行原位杂交，故操作步骤繁琐，用时长。
3．原位逆转录PCR 是将逆转录反应和PCR相结合，在原位检测细胞内低拷贝mRiNA的方法。整个反应分两步进行．*步以mRNA为模板，在逆转录酶催化下合成cDNA；第二步则以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增，zui后用标记的探针与扩增的cDNA进行原位杂交而间接检测细胞内的mRNA。该方法的优点是不需从标本中提取mRNA，不会因在核酸的分离中造成靶序列破坏而致信号丢失。与液相PCR不同的是，原位RT-PCR反应过程在固定的组织或细胞标本上进行，标本需先用DNA酶处理以破坏组织细胞中的DNA，以保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的
DNA。其余基本步骤与液相的RT-PCR相似。
就具体方法而言，原位逆转录PCR与上述原位PCR一样，也可分为直接法和间接法，操作时的注意事项也相似，不同的是在进行原位逆转录PCR时要特别防止RNA酶对待测核酸的降解。另外，由于在原位PCR前要进行逆转录过程。因此实验周期较长，操作过于复杂。但随着将逆转录酶和Taq DNA聚合酶功能合二为一的新型reverse transcription thermal（rTth）酶的商品化，原位逆转录PCR整个操作过程与普通原位PCR十分相似。其方法是将待测核酸与rTth酶、特异性引物和含有标记的dUTP和dNTP同时滴加于切片上。在原位PCR仪上先用600c温浴30分钟，以从待测mRNA逆转录cDNA，再经20个PCR循环。扩增特异性cDNA，并同时使扩增的cDNA片段中掺人标记物，zui后用组织化学或免疫组织化学方法检测阳性信号。
