4 分钟教你学会多重 PCR 引物设计
设计策略
MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此，进行多元 PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。
理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。
多元 PCR 引物设计和优化的一般规律
当设计 MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一些因素也必须考虑。一般 来说，一个多元反应中使用的所有引物的 Tm 值应该接近，要避免 3'-核苷酸互补，每一对引物应独立地优化其反应条件。一旦将引物集中，需按顺序混合，然后再进行优化。
1. 引物长度应为 18~24 个碱基，较长的引物更容易形成引物二聚体。
2. 对于 MPCR，退火温度和循环数非常关键。要尽可能提髙退火温度，要确认每一对 引物单独扩增时的退火温度，然后在多元 PCR 反应时采用最低的退火温度。同样，要采用最少的扩增数。
3. 由于多个模板同时扩增，酶量和核苷酸浓度可能成为限制因子，而且完全合成所有 产物所需的时间增加。因此，优化每个反应的试剂浓度和延伸时间就显得非常重要。相对于 单个目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸时间较长。
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