复习细胞内DNA复制条件和过程。

一、目的
1：学习PCR技术的基本原理
2：掌握从全血中制备DNA的方法‘
3：掌握应用PCR扩增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因结构

二、原理
1：PCR扩增的原理
聚合酶链反应—PCR是一种体外基因扩增技术，是在引物和四种脱氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反复作用，使微量的特定片段得以大量扩增的反应过程。
PCR所需的条件：模板
引物：决定扩增产物的特异性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg ²⁺
PCR反应过程

每三步为一个循环，每循环一次，使模板DNA拷贝数增加1倍，理论上讲，30个循环后，扩增产物为2 ³⁰ 拷贝

本实验应用PCR技术扩增Hbβ基因上400bp片段
引物序列为 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR产物的鉴定
含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳
DNA在pH8.0电泳缓冲液环境下带负电荷，向阳极移动。DNA分子量大小及形状不同，电泳速度不同。在分子形状相同的条件下，分子量（bp数）越大，电泳速度越慢；分子量（bp数）越小，电泳速度越快；分子量（bp数）相同，电泳速度相同。所以PCR扩增产物可以根据分子量（bp数）的大小进行分离。bp数相同的DNA集中在同一位置上，与EB结合成复合物，在紫外灯激发下，发出桔红色的荧光，而形成桔红色的区带，根据Maker判断扩增产物的长度。
三、 仪器 与试剂
（一）主要 仪器 ：PCR仪 潜水式电泳仪 微量移液器 台式高速离心机
（二） 试剂 ：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理盐水 双蒸水
PCR反应液 液体石蜡 载样缓冲液 电泳缓冲液
四、方法
（一）模板的制备
裂解细胞膜 1：用刻度 离心管 取全血0.5ml，加裂解液至3ml，颠倒混匀，振荡60～80次。3,000rpm离心10分钟。
去血红素 2：弃上清，加生理盐水至3ml，振荡直至沉淀成线状，3,000rpm离心10分钟。
3：重复步骤2一次
破坏细胞核膜 4：弃上清， 离心管 倒置在滤纸上控干，加ddH ₂ O 50μl,用枪头搅动沉淀，直至沉淀完全溶解。
去除蛋白质 5：全部转移至1.5ml 离心 管，沸水锅中煮沸10分钟，12,000rpm离心5分钟，上清液即含有模板DNA。