四氢异喹啉生物碱的精巧生物合成
四氢异喹啉生物碱（tetrahydroisoquinoline alkaloids, THIQAs）是一类重要的天然产物，通常在C-1位含有苄基（即苄基异喹啉生物碱，BIAs）或苯基（即苯基异喹啉生物碱，PIAs）并具有显著的生物活性（图1）。目前，临床上已经应用十几种天然或半合成的THIQAs来治疗多种疾病。不过，自然条件下多数THIQAs只存在于各种植物中，提取不易，因此科学家们一直致力于开发其人工合成方法。然而，不对称催化等化学合成法对映选择性较差，成本昂贵，无法进行商业规模生产。于是不少科学家将视线转向生物合成。在天然产物中，四氢异喹啉（THIQ）骨架通过去甲乌药碱合成酶（norcoclaurine synthases, NCSs）催化的Pictet-Spengler反应进行生物合成（图2A）。随着对BIAs生物合成理解的日益深入，在微生物宿主中引入植物的部分或者全部生物合成途径相关基因，通过生物合成法来生产BIAs已经成为一种可行的策略。相比于化学合成法，这种方法更经济、操作更简单，从而更具有吸引力。然而，通过微生物生产植物THIQAs仍然存在许多挑战，比如：（1）对于PIAs及许多BIAs的生物合成途径的理解，目前还并不清楚，难以转移到微生物中，目前有成功报道的也只是少数BIAs；（2）大多数高价值THIQAs都带有许多取代基，例如在C6、C7、C3'和C4'位置上带有甲氧基；（3）在微生物中引入植物基因一方面会加大微生物的代谢负担，另一方面，不少植物酶在微生物系统中表达较差或者活性较低。此外，NCSs的底物范围窄，难以用于合成多种THIQAs。
图1. 代表性的THIQAs。图片来源：Chem. Sci.
近日，上海交通大学和武汉大学的瞿旭东教授课题组发展了一种生物催化方法，使用亚胺还原酶（imine reductases, IREDs）和N-甲基转移酶（N-methyltransferase, NMT）从二氢异喹啉（DHIQ）前体出发合成植物THIQAs（图2B）。亚胺还原酶IR45的工程化，可显著扩展其底物特异性，从而可以将1-苯基和1-苄基6,7-二甲氧基-DHIQs高效且立体选择性地转化为相应的(S)-四氢异喹啉（(S)-THIQs）。乌药碱N-甲基转移酶（CNMT）能够进一步有效地将这些(S)-THIQ中间体转化为(S)-THIQAs。通过在一个反应中结合IRED、CNMT和葡萄糖脱氢酶（GDH），他们在大肠杆菌中构建了两种人工模拟生物合成途径，并成功地将其应用于5个(S)-THIQAs的合成。这种高效（自DHIQs产率100％）且易于调控（添加其他基因）的生物合成方法适用于生产各种植物THIQAs。相关成果发表在Chemical Science 上。
图2. 植物THIQA的生物合成法。图片来源：Chem. Sci.
Cryptostyline I、II和III（1-3，图1）是从植物中分离出的三个有代表性的PIAs，作者选择它们作为本研究的目标。通过化学合成，以较好的收率（90-91％）得到三种cryptostyline（1-3）的1-苯基-6,7-二甲氧基-DHIQ前体（1a-3a，图3）。先前的研究表明(S)-IRED IR45对1-苯基-DHIQ具有良好的耐受性，因此选择该酶用于新底物的活性测定，结果表明IR45能够有效地将1a还原为(S)-1-亚甲基二氧苯基-6,7-二甲氧基-THIQ（1b，图2），转化率为100％，ee 值≥99％（图4），但它对两个空间位阻较大的底物2a和3a却没有活性。
图3.本研究中涉及到的DHIQ底物。图片来源：Chem. Sci.
图4. IR45及其突变体对1a-5a的转化率和对映选择性。图片来源：Chem. Sci.
作者进行了底物1a与IR45的分子对接研究，在IR45结合口袋中，计算模型显示1a被天冬氨酸（D183）和NADPH紧密包围（图5）。其中亚胺键的位置靠近NADPH的si-面，这与产物的S-构型一致。从模型中可以看出，右侧的裂口是容纳亚甲基二氧苯基的主要限制因素（图5）。然而，对该区域进行酶工程可能会严重损害酶的活性和稳定性。因此，作者设想通过突变结合口袋底部的F190和W191残基，或许可以扩大结合口袋，让底物进入左腔稍微深一些，从而有可能减少右侧裂口与底物2a和3a之间的空间位阻。先前的研究显示W191在底物结合和维持酶的催化活性构象中发挥着重要作用。随后将W191进一步突变并对其进行动力学分析，结果表明W191F对酶的催化构象影响最小。接着，作者将W191F顶部的其他19个残基进行突变，结果显示突变体F190L-W191F能够显著提高2a和3a的活性（24 h内的转化率分别为75％和100％），并且产物2b和3b的立体选择性很好（图2、图4）。这些结果说明，通过酶工程作者成功地拓宽了IR45的底物特异性，并使有效地将大位阻DHIQ前体转化为相应的THIQ。
图5. 底物1a和4a与IR45结合的模型。图片来源：Chem. Sci.
接下来，作者将IR45应用于BIAs的合成。值得注意的是，野生型IR45能够有效地将DHIQ底物4a和5a转化为相应的(S)-THIQ（转化率100％；ee 值> 99％）。最佳突变体F190M-W191F能够显著提高对4a和5a的催化活性（图6）。有趣的是，野生型IR45所不能催化转化的大位阻底物2a和3a，其平面骨架却比4a和5a的还要小一些，这有点让人意外。为了探索酶腔中结合的差异对催化活性的影响，作者进行了4a与IR45的分子对接研究（图5B）。计算分析表明4a的DHIQ平面与1a的构象相同。不同于1a，4a的苄基向右侧裂口下方的大空腔弯曲，这种定位上的差异可能会减少原本较大的底物4a的空间位阻。
图6. IR45及其突变体与1a-5a转化的酶动力学研究。图片来源：Chem. Sci.
接下来，作者研究了N-甲基化步骤。CNMT是(S)-reticulene合成过程中的关键酶，作者分析了它对THIQ底物1b-5b的N-甲基化活性。为了改善表达，作者将CNMT基因针对大肠杆菌进行了密码子优化。而且结果也让人满意，CNMT在大肠杆菌中得到了很好的表达。得到的CNMT能够有效地将所有的S-THIQ底物转化为相应的N-甲基化产物（转化率100％）。作者随后尝试将亚胺还原酶和N-甲基化酶结合起来，他们用纯化的F190L-W191F和F190M-W191F与CNMT和GDH（用于从葡萄糖中回收NADPH），分别合成了THIQAs 2、3和1、4、5。反应结果也让人满意，底物转化率为100%。
在这些结果的支持下，作者尝试在大肠杆菌中构建THIQAs的人工生物合成途径。为了达到最高的转化效率，每个步骤都在大肠杆菌系统中进行了单独评估，然后进行条件优化。首先作者在单个细胞中共表达了三种酶IRED、NMT、GDH，构建了微生物中合成THIQAs的最小生物合成途径。在最佳条件下，1a、4a和5a（50 mg L-1）可以在一到三天内完全转化为相应的生物碱（图7和图8）；通过乙酸乙酯萃取，可以分别以95％、98％和95％的产率获得纯生物碱1、4和5。为了克服细胞膜通透性的障碍并进一步提高2a和3a的转化率，作者将酶促转化和全细胞生物转化结合到一个反应中。F190L-W191F和GDH这两种酶首先过表达，并通过超声裂解得到粗酶液，随后直接加入到表达CNMT的大肠杆菌的培养液中，这种酶促转化和全细胞生物转化的结合可以将2a和3a（50 mg L-1）完全转化为相应的THIQAs（图7和图8），2和3的分离产率分别为93％和96％。这些结果表明，通过系统性地提高酶活性并优化生物催化条件，作者发展的基于IRED的人工生物合成途径可成功地用于两种类型植物THIQAs的合成。
图7.前体1a-5a通过IRED的方法生物合成1-5。图片来源：Chem. Sci.
图8. 基于IRED生物合成THIQAs 1-5。图片来源：Chem. Sci.
总结
瞿旭东教授课题组使用一种基于IRED的生物催化策略，成功地生物合成5种在药学上有价值的PIAs和BIAs。值得注意的是，这3种PIA的天然生物合成途径目前尚未研究清楚。通过酶工程，作者显著拓宽了IRED IR45的底物特异性，两个突变体F190L-W191F和F190M-W191F可以有效地将大位阻1-芳基-6,7-二甲氧基-DHIQ底物转化为(S)-THIQs，CNMT也能够实现大位阻底物的转化，再将(S)-THIQs转化为(S)-THIQAs。这种基于IRED的生物合成法可高效（100％收率）制备多种植物THIQAs，通过添加其他酶（如P450），还有望进一步扩展到其他复杂THIQAs的生物合成中。
