结果与讨论

系统筛选

方法开发过程对色谱柱、改性剂和改性添加剂进行了系统筛选，以获得最佳分离结果。初始的配置通过四种改性剂对四种UPC²色谱柱进行了筛选。“改性剂”是强溶剂流动相，有利于洗脱极性较强的分析物。所使用的四种溶剂分别是甲醇、含0.5%甲酸的甲醇、含2 g/L甲酸铵的甲醇和含0.5%三乙胺的甲醇。筛选过程采用溶剂B在5 min内从5%增加至30%，达到30%时保持1 min的常用梯度。总筛选时间仅两个多小时。对比各色谱柱所得峰可以发现，含有甲酸铵的甲醇总体上可提供最好的峰形，如图2所示。方法筛选过程中通过查看ACQUITY SQD提供的质谱图实现峰跟踪。对于极性较强的分析物，选择性(α)有很大不同。在这些对比实验中，流动相保持恒定，因而不断变化的α是由[固定相 – 溶质]相互作用所导致。

图2. 色谱柱筛选结果。改性剂(B)是含有2 g/L甲酸铵的甲醇。溶剂B在5 min内从5%增加至30%，达到30%时保持1 min。

基于这些结果，UPC² 2-EP固定相是最佳的色谱柱选择，可以为大多数分析物提供更好的峰形和分离度。UPC² CSH Flouro-Phenyl色谱柱可以提供较好的选择性和峰形；但是，杂质C未能按预期分离成两个峰。这种未知现象将在未包括在本应用纪要中的另一组实验中进一步考察。

梯度斜率的影响

在反相LC中，梯度斜率是控制选择性和分离度的常用工具。使用UPC² 2-EP固定相，延长总的梯度运行时间可以降低梯度斜率。斜率的改变对色谱图基本没有影响，仅使峰6和7之间的选择性发生改变，如图3所示。

图3. 归一化的x轴叠加显示甲氧氯普胺，采用延长的12 min和35 min梯度运行时间，其斜率较6 min的筛选实验更小。使用原始梯度；溶剂B由5%增加至30%。

不同洗脱溶剂的影响

使用变化率较平缓的梯度并未增加峰与峰之间的分离度。为提高分离度，将低极性非质子有机溶剂（乙腈）与甲醇（极性较强的洗脱溶剂）以不同比例混合。乙腈的添加提高了分离度，扩展了峰之间的分离间隔。这些现象证明本方法可在方法开发中发挥重要作用，如之前发表的结果所示。

图4. 如叠加图中突出部分所示，在改性剂成分中添加乙腈后，后部洗脱分析物的分离度明显提高。

添加剂的影响

添加剂可以增强或掩盖分析物与固定相之间的相互作用。甲氧氯普胺杂质具有多种不同的侧链。表1所列的相关杂质展示了不同的侧链：胺基、羧基和羟基。因此，选择合适的添加剂极具挑战性。甲酸铵能够改善混合物中多种化合物的峰形。筛选过程中考察的其它添加剂可以改善其它分析物的峰形，例如杂质H；但也会对混合物中的其它组分造成影响。

在添加剂筛选过程中，我们也考察了每种杂质各自的标准品。甲酸可以优化杂质H的峰形；但是，它会影响其它相关物质的色谱分析性能。添加剂的浓度也会对峰形产生影响。为了得到更理想的峰形，浓度需要高于反向LC的常用浓度。增加甲酸的浓度可以进一步改善杂质H的峰形，如图5所示。但是，杂质F的峰形受到了影响，如图6所示。组合使用甲酸和甲酸铵可同时获得两种添加剂的优势，使全部的分离均获得最佳峰形。在改性剂中使用添加剂甲酸和/或甲酸铵对过期样品进行分析所得结果如图7所示。在此对比实验中使用过期样品使我们能够更好地评估已知杂质在存在未知杂质条件下的选择性和峰形。如图7所示，解决峰形问题最终会影响色谱分离的效率、分离度和灵敏度。

图5. 两种改性剂的对比：含0.1%甲酸的甲醇与含1%甲酸的甲醇。极性分析物（用框标出）的分离随着添加剂浓度的增加而得到改善，而较中性的组分并未受到影响。（请参阅“实验”部分获取其它方法参数。）

图6. 带羟基（或多酚类）功能的峰，例如杂质H在仅使用甲酸时峰形最好，如图5A所示。具有伯胺、仲胺和叔胺功能的化合物（杂质F）在使用铵盐类添加剂时可获得最佳峰形，如图5B所示。

图7. 过期甲氧氯普胺样品的分析，改性剂中分别添加不同的添加剂成分。将甲酸铵和甲酸组合，称之为“类缓冲液”系统，此系统可使样品中的所有分析物均获得最佳峰形。所使用的改性剂为50:50的甲醇/乙腈。

评估特异性

在确定可对选择性、分离度和峰形产生积极影响的方法条件后，各变量同时获得了优化。实验使用甲氧氯普胺和杂质（对照）的标准混合物和过期的样品混合物对最终方法进行了评估，如图8所示。有关未知杂质的进一步考察，请参阅沃特世（Waters® ）应用纪要。

图8. 采用“实验”部分中列出的最终方法条件对甲氧氯普胺对照混合物和降解混合物进行的对比分析。

结论

本实验使用ACQUITY UPC²系统成功对甲氧氯普胺及其相关物质进行了非手性分析。了解杂质结构的特性有利于方法开发。实验中分析的多种杂质包括胺类、羟基、酯类和羧酸。能够影响选择性、分离度和峰完整性的主要方法变量分别是固定相、改性剂的洗脱强度和添加剂的组成。最后甲氧氯普胺相关物质的分析方法展示了此方法对过期甲氧氯普胺样品的特异性。

本方法开发过程通过色谱柱筛选处理中的对比实验揭示了多种[固定相 – 分析物]相互作用。更多的相互作用需要在已发表的研究基础上进行进一步的探索。了解这些方法变量相互作用的影响将有助于创建一种更加适用的方法开发技术。