NTA用于外泌体定量的准确性
希尔博士的意见是：
NTA可以提供样本中颗粒的粒径分布和绝对浓度，但不能够以NTA所提供的浓度数值这个单一的指标来定量外泌体。
首先，我们必须理解NTA检测原理：该技术基于布朗运动，通过视频分析颗粒计数，可同时获取样本中颗粒的粒径和绝对浓度。
因此，样本中的所有颗粒，都会被侦测并计入，而不能筛选出外泌体单独进行计数；同理：也不能通过NTA所提供的粒径分布情况这个单一的指标判断所提取出的内容物就是外泌体；例如下图为常见的粒径浓度分布图，可以说明所提取的内容物是在外泌体粒径范围内，但是否为外泌体还需要结合其他方法综合验证，譬如：透射电镜、western blot等。
某外泌体样本的粒径-浓度分布图（检测方法：NTA）
那到底怎样可以定量外泌体呢？
我们来看一下国际胞外囊泡协会（ISEV)新发布的Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018（简称MISEV 2018)是如何说的：
EVs have a particulate structure and contain proteins, lipids, nucleic acids, and other biomolecules. Quantification of each of these components can be used as a proxy for quantification of EVs, but none of these values is necessarily perfectly correlated with EV number.
这段话是说：EVs（extracellular vesicles）有其独特的结构和内含物（蛋白、脂质体、核酸和其他生物分子）。用其中任意一个指标来定量EVs都是可以接受的，但也没有任何一个值能确切反映EV的数量。
所以，目前没有完美的外泌体定量方法。
当然，正如MISEV2018所述，大家还是可以基于EVs独特的结构和内含物来进行定量：
颗粒数
利用NTA、FCW、TRPS、SPR等都可以用于颗粒计数，不同平台得到的数值会有差异。
当然，以颗粒数来定量外泌体，通常都会高估，因为如果外泌体样本中存在脂蛋白、蛋白团聚等，这些杂质也会被一起计入。荧光模式下的NTA检测可以实现检测特定亚群的EVs，前提是对EVs的特殊表达蛋白进行荧光标记。
总蛋白量
可用比色法（Bradfold或BCA）、荧光法或直接在SDS-PAGE染色检测总蛋白量。由于容易存在其他蛋白的污染，这个方法同样容易高估囊泡数量。另外，是否使用detergent也会对结果有影响，因此如使用detergent，需要指明种类和使用浓度。
总脂质量
此方法利用亲脂性荧光染剂（譬如：DiR）等检测，但需要考虑背景值里其他脂质成分的干扰。
总RNA量
不是很推荐的方法，因为如有核糖体蛋白或脂蛋白也会影响检测的数值。
EVs特殊标记物定量
此方法基于特异性表达蛋白（例如：CD9、CD81或CD63等），使用ELISA、时间分辨荧光免疫分析法（TRIFic CD9/81/63 Exosome Assay， Cell Guidance Systems）、FCW或纳米管比色法定量特定亚群的外泌体数量。
上述各方法都不完美，因此实际上，外泌体的研究过程中，经常需要结合不同定量数据作为纯度的参照，例如蛋白/颗粒比、蛋白/脂质比或蛋白/RNA比等。
