elisa试剂盒对免疫荧光实验的具体方法步骤

现代的经济在发展、科研技术也在发展，我们的生活水平质量在提高，我们对实验技术的视野也是同样的在不断开拓。elisa试剂盒为您细说免疫荧光实验的具体方法步骤，上海劲马精益求精，力求销售的高质量试剂产品能够为科研事业做出贡献。今天，我们要给朋友们讲说的也是相关实验方法，免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

1、细胞准备

对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

2、固定

根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。

解析：固定的目的。

目的一：防止细胞从玻片上脱落；

目的二：除去防碍抗原-抗体结合的类脂；

目的三：使标本易于保存。

整理：固定原则。

原则一：不能损伤细胞内的抗原；

原则二：不能凝集蛋白质；

原则三：应保持细胞和亚细胞结构；

原则四：固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。

通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。

在这里上海劲马生物为朋友们说明，一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，*后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光，那么下面来看看通透。

3、通透

使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

4、封闭

使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。目的是为了减少抗体的非特异性结合，*常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。

5、一抗结合

室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

6、二抗结合

间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。

7、封片及检测

滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。