蛋白质的性质实验原理和操作步骤-1

【目的和要求】
1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。
2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。
3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。
【实验原理】
（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应
蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。
1. 双缩脲反应
尿素被加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。
所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。
蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。
2. 茚三酮反应
蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。
除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。该反应灵敏度达1：1500 000（pH5-7）。现已广泛地用于氨基酸定量测定。
3. 黄色反应
凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色反应。
(二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定
蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶液的pH值低于蛋白质等电点时，即在 H+ 较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点时蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。
(三) 蛋白质的沉淀反应
蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型:
1. 可逆沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应称为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用以及等电点沉淀等。
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。

沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐析。它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。