单克隆抗体的细胞如何选择？

2021.11.28

(一)脾细胞

1.材料

(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

单克隆抗体制备流程

(2)1640培养液(3)2.5%FCS-1640营养液

2.操作方法

(1)拉颈或用CO2处死小白鼠。

(2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。

(3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。

(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。

(6)以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min～10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。

(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

(8)重复⑹、⑺步骤。

(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格。

(二)骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件:

①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;

②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;

③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;

④生长速度快,繁殖时间短。

常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:

①S194/5XXO·BU·1;

②SP2/0—Ag14(简称SP2);

③P2—X—Ag8·6·5·3(简称653);

④FO以653最为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(MinerolOilplasmacytoma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8-氮鸟嘌呤。取约1×107～6×107对数生长期(即培养15h～20h)的骨髓瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。

(三)饲养细胞

在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。

应用腹腔渗出细胞的好处是:

一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。

1.材料

(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。

(2)11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。

2.操作方法

(1)拉颈处死小鼠。

(2)70%酒精浸泡消毒10min。

(3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。

(4)用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。

(5)1000r/min离心10min。

(6)弃上清,以HT培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。