清华大学张新荣近年来单细胞质谱分析领域工作进展概览
张新荣，清华大学教授，博士生导师。兼任中国分析测试协会副理事长，北京质谱学会理事长，英国皇家化学会会士，Analytical Chemistry（ACS）执行主编。张新荣教授课题组近年来致力于单细胞质谱分析研究，与同行学者和企业合作，研制了液滴微萃取-皮升电喷雾质谱单细胞分析仪、免标记质谱流式细胞仪以及极紫外激光电离质谱单细胞成像分析仪等，并将其用于单细胞乃至亚细胞区域代谢组的分析和空间单核代谢组的分析等。
本文选取张新荣教授课题组近年来在单细胞质谱分析领域的相关文章来介绍课题组最近的主要研究工作。
（一）液滴微萃取-皮升电喷雾质谱单细胞分析研究
从大量正常细胞中将癌细胞筛选出来，对癌细胞亚型进行代谢分型及潜在的标志物分子的筛选，对于癌症诊断和治疗有重要意义。该课题组在大量前期工作的基础上，与宁波华仪宁创仪器公司合作，研制了一台液滴微萃取-皮升电喷雾质谱单细胞代谢物分析仪器，能够提取细胞内数百种代谢物并利用多级质谱对潜在的标志物成分进行分子确认。
图1. (a) 液滴微萃取结合皮升电喷雾（Pico-ESI）质谱工作流程。在2分钟内从单个细胞中获得了超过600个MS2。(b,c) Pico-ESI相比Nano-ESI提供了更充足的单细胞分析时长。(d) 单细胞代谢物分析全自动样品处理系统SinCell-100。
使用微纳液滴对癌细胞代谢物进行萃取，并应用Pico-ESI延长电喷雾时间，能够记录来自单个细胞的600多个代谢物的串联质谱图（MS2），识别出超过300种磷脂分子，最终发现胶质母细胞瘤细胞中不饱和比饱和磷脂酰胆碱（PCs）的比值明显高于正常细胞（Anal. Chem. 2018, 90, 9897-9903）。
该课题组还采用极性不同的萃取剂进行两步萃取和电喷雾质谱测定，进一步提高了代谢物的覆盖度。细胞内包含的代谢物种类丰富，具备不同的极性和溶解性。通过两步萃取结合质谱分析从单个细胞中提取了千余个来源于脂质、能量代谢物等小分子的特征离子信号m/z，成功区分了四种乳腺癌亚型，筛选出若干种潜在的生物标志物（Anal. Chem. 2019, 91, 3667-3674）。
亚细胞尺度的分析可以揭示代谢物在胞内不同细胞器区域的富集分布。该课题组与北海道大学合作，在亚细胞层级（<10 μm）上分离和分析了单个脂滴（LD）中的磷脂酰胆碱和甘油三酸酯。该方法已成功应用于HepG2细胞中单个LD水平上三种不同LDs的脂质分布研究，将单细胞分析深入到亚细胞区域（Anal. Chem. 2019, 91, 4466-4471）。
图2. (a,b) 针尖吸取单个脂滴前后的明场观察图像。(c) m/z 760.58 (PC 34:1) 和 m/z 902.82 (TG 54:3)的提取离子流图。(d,e) PC 34:1和TG 54:3随溶剂梯度被先后检出。(f) Anal. Chem. 2019, 91, 7 的封面报道。
（二）免标记质谱流式细胞分析平台
将质谱的代谢物检测能力和流式细胞系统的高通量特点相结合，能够加快单细胞代谢物筛选的速度，实现样本中大量细胞的高通量快速检测，进而实现对病人体液样本中癌细胞的识别和分子组成分析，有望为临床癌症诊断提供更为丰富的信息。为此，该课题组在上述单细胞质谱仪器研究的基础上，建立了免标记单细胞质谱流式平台（CyESI-MS）。相对于传统荧光流式细胞技术，有机质谱流式细胞技术提供了更为丰富的单细胞分子指纹的信息，用于更好地区分正常细胞与癌症细胞，并对癌细胞进行了更为精准的分型。此外，相比于免疫分析，免标记代谢分析摒弃了标记程序，大大简化了操作程序，加快了检测的速度，有望用于临床癌细胞在单细胞尺度的精准诊断（Anal. Chem. 2019, 91, 9777-9783）。
白血病是造血干细胞出现恶性克隆而引发的异质性疾病，不同类型急性白血病有着截然不同的化疗方案和预后效果，因此在单细胞水平上对白血病细胞的准确分型具有重要的意义。该课题组从5种亚型白血病单细胞质谱图中，提取出480个代谢物相关的离子峰并比较其指纹图谱，发现存在明显差异，进一步筛选并指认出了36种存在显著性差异的代谢物，仅使用其中4种代谢物（谷胱甘肽、PC(32:1)、PC(O-34:1)、PC(P-34:0)）即可区分5种不同亚型的白血病单细胞，验证了该方法在筛选生物学标志物方面存在的巨大潜力（Anal. Chem. 2021, 93, 10282-10291）。
图3. 细胞代谢指纹图谱用于鉴别白血病细胞。(a) 五种白血病细胞系1923个单细胞的代谢谱热图（正离子模式）。(b) 基于至少一种白血病亚型中检出率大于90%的离子峰的无监督学习t-SNE聚类分析。(c) 五种白血病细胞系和一个混合样本的t-SNE聚类分析。(d) 混合细胞样品的检测序列。
自然杀伤细胞（NK细胞）是一种重要的免疫细胞。由于肿瘤细胞所处微环境不同，其对NK细胞的抗性也存在着明显的差异，因此在单细胞水平上研究NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力具有重要意义。该课题组从被NK细胞杀伤的单个癌细胞中提取出330余个代谢物相关的离子峰，进一步筛选并指认出了19种存在显著性差异的代谢物，并发现部分代谢物如谷胱甘肽等与NK细胞数量高度相关，通过肿瘤细胞对于NK细胞杀伤的异质性，进一步实现了肿瘤细胞的精细化分型（Chem. Sci. 2022, 13, 1641-1647）。
图4. NK细胞诱导HepG2细胞凋亡特异性代谢物的变化。(a) 19种不同效靶比下比值特征代谢物的平均相对强度对数雷达图。(b) NK细胞诱导的细胞凋亡过程中，有几个代谢途径受到影响：(1) 甘油磷脂代谢，(2) D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，(3) 牛磺酸和下牛磺酸代谢，(4) 谷胱甘肽代谢，(5) 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。凋亡过程中单个细胞中 (c) 谷胱甘肽、(d) 谷氨酸、(e) 肌酸、(f) 牛磺酸相对强度的变化。
（三）空间单核代谢组学方法
肿瘤细胞亚群间的异质性不仅反映在组成成分之间的差异，还存在空间的异质性差异。这不仅由于肿瘤亚群在单个疾病部位内或不同疾病部位之间分布不均，肿瘤细胞与其周围微环境间的相互作用亦会对细胞的异质性产生影响甚至促进肿瘤进展。因此，定位单个细胞在组织网络中的位置、区分相关代谢物的指纹图谱差异、确定重要代谢物的分子组成、研究微环境中分子分布的影响，对于单细胞代谢组学研究有重要的意义。
该课题组与同行合作开发了空间单核代谢组学方法（SEAM），将显微光学成像与TOF-SIMS的高空间分辨率质谱成像相结合，使用大约1.5 µm的像素大小，从400×400 µm2的组织区域记录多达300种离子物种的原位代谢曲线，并结合机器学习算法，可进行组织原位单细胞核水平上的代谢物可视化图像识别、代谢特征信息提取、以及单细胞的聚类、差异化分析和微环境影响研究。
在方法学研究基础上，该课题组对小鼠肝脏切片中的细胞核进行了分析，确定了724个不同的细胞核，同时报告了它们的代谢组。TOF-SIMS代谢组学数据集的建模揭示了细胞核化学性质不同的细胞亚群。这一发现与报道的通过蛋白或者基因表达所验证的肝组织分区现象（liver zonation）高度一致，有效证明了SEAM方法的可靠性和准确性。
图5. SEAM的概述。左上，玻片上的组织样本被TOF-SIMS分析，右上是质谱和离子图像的多重SIMS数据。左下，小鼠肝脏CV区H&E染色。底部中间，用SIMS-View获得彩色编码的像素可视化。右下，由SIMS-Cut、SIMS-ID和聚类等顺序算法获得空间单核图。比例尺，100 μm。
在成功构建了基于高分辨质谱技术的细胞器空间代谢组学分析方法后，该课题组还研究了肝癌组织切片中细胞核的代谢状态，区分了肝细胞亚群与纤维化微环境的关系。肝纤维化样本中存在着2种有明显代谢差异的肝细胞亚群，区分亚群细胞的主要特征在于谷丙酰胺含量的上升及其对应的跨膜转运蛋白的基因表达上调。该课题组将代谢组学与转录组学进行了结合，证明了代谢组学分型的准确性与可靠性，并提供了其他组学无法提供的大量代谢物异质性信息。SEAM方法系统解析了组织空间中的单细胞代谢组，对于整个单细胞技术领域的进步具有重要的推进作用（Nat. Methods, 2021, 18, 1223-1232）。
图6. (a) 小鼠肝组织差异代谢谱分析。(b) 以代表性差异代谢特征的强度着色的UMAP。(c) 肝细胞C1标志物之一m/z 87.00的空间分布。左：肝细胞C1的空间定位与m/z 87.00的灰度离子图像合并。中间为m/z 134.04 (蓝色) 和m/z 87.00 (红色) 的离子图像叠加。右，梯度定位分析突出了CV区 (黄色虚线区域) 周围m/z 87.00的代谢伪流。比例尺，100 μm。
以上为张新荣教授课题组近年来在单细胞质谱分析领域具有代表性的工作成果，其它更多具体详细的信息请参考课题组的网站：http://xrzhanggroup.com/%E9%A6%96%E9%A1%B5/
张新荣教授课题组合影
